藏猪胃肠道微生物组的宏转录组分析揭示其功能特征

《Animals》：Metatranscriptomic Analysis Reveals Functional Features of the Gastrointestinal Microbiota in Tibetan Pigs

　　

摘要：藏猪对低氧高海拔环境表现出显著的适应性。然而，宏转录组学尚未被用于研究胃肠道微生物群的转录活性及其功能反应，以揭示其作为高海拔适应机制的一部分。研究人员收集了6头高海拔藏猪（n = 6，海拔3750 m）和6头低海拔黑猪（n = 6，海拔500 m）的胃、空肠、盲肠、结肠和直肠内容物共57份样本，进行宏转录组分析。研究人员鉴定出79个差异丰度细菌属和69个差异丰度细菌种。特别地，卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）和德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）在高海拔藏猪胃肠道微生物群中的丰度显著高于低海拔黑猪。功能分析揭示了与能量、碳水化合物和氨基酸代谢相关的转录本差异。藏猪的微生物相关性网络比黑猪包含更多的节点和边。与此一致，在CAZyme数据库中，CBM32家族碳水化合物结合模块和GH27糖苷酶在藏猪样本中显著富集，表明这些酶可能在这些猪的能量获取和碳源代谢中发挥关键作用。这些发现为藏猪和黑猪的胃肠道微生物特征提供了见解。总之，这些变化可能增强藏猪肠道生态系统的稳定性，并改善其在营养缺乏的高海拔环境中的能量利用效率。这些发现表明，肠道微生物群可能有助于藏猪在高海拔地区的代谢调节，并为高海拔动物的胃肠道适应提供了重要线索。

藏猪胃肠道微生物组宏转录组分析：高海拔适应的功能特征解读

一、研究背景与科学问题

青藏高原平均海拔约4000米，是地球上最高的高原，其极端环境条件包括低氧、严寒和强紫外线辐射，对哺乳动物的生存构成重大生理挑战。藏猪（Tibetan pigs, TPs）是原产于该地区的家畜种群之一，主要分布于青藏高原的农牧交错带，其表现出浓密鬃毛、厚肺泡隔和致密毛细血管网络等与高海拔适应相关的形态学和生理学特征，使其成为研究高海拔适应机制的重要遗传资源。

胃肠道的主要功能是消化食物和吸收营养，猪的肠道微生物群通过发酵膳食纤维产生短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）、合成维生素和调节神经递质前体水平等方式影响宿主的能量代谢和免疫反应。近年研究表明，肠道微生物群可能在哺乳动物高海拔适应中发挥重要作用。例如，高海拔地区人群肠道微生物群中普雷沃氏菌属（Prevotella）的相对丰度显著高于低海拔地区人群，该菌属通过分解复杂多糖为宿主提供能量。藏羚羊的肠道微生物群也具有更强的纤维发酵能力，其能量代谢相关基因的表达水平显著高于低海拔地区动物。

与宏基因组测序相比，宏转录组测序不仅能揭示微生物群落的组成和结构，还能捕获肠道微生物群表达的基因，从而反映微生物在特定环境变化、病理状态或饮食因素下的代谢动态和功能活性。已有研究表明，在高海拔低氧条件下，牛和藏羊的肠道微生物群通过调节能量代谢、促进造血和增强抗氧化防御等方式帮助宿主适应环境。然而，针对栖息于高海拔环境的藏猪胃肠道微生物群的系统性宏转录组研究仍然缺乏。因此，本研究旨在通过宏转录组测序，系统比较高海拔藏猪与低海拔黑猪胃肠道微生物群的组成和功能差异，为理解肠道微生物群在哺乳动物高海拔适应中的作用提供新的视角。

二、研究设计与技术方法

研究人员分别在高海拔地区（四川稻城，海拔约3750 m）饲养6头藏猪和低海拔地区（四川遂宁，海拔约500 m）饲养6头四川黑猪，经300天稳定期后采集其胃、空肠、盲肠、结肠和直肠五个胃肠道部位的内容物样本共60份，其中57份通过质量控制并用于后续分析。主要技术方法包括：使用QIAzol裂解试剂提取微生物RNA并进行质量评估；利用Ribo-Zero rRNA去除试剂盒富集mRNA后构建cDNA文库，在Illumina NovaSeq平台进行PE150双端高通量测序；通过FastQC和Trimmomatic进行数据质控，使用Bowtie2比对猪参考基因组去除宿主污染，利用Trinity进行转录本组装和Corset聚类生成非冗余unigene；采用DIAMOND比对KEGG数据库进行功能注释，比对Micro_NR数据库进行物种分类注释，比对CAZy数据库进行碳水化合物活性酶（CAZyme）注释；通过α多样性指数（ACE、Chao1、Shannon、Simpson）和β多样性分析（Bray-Curtis距离、PCoA、PERMANOVA）评估微生物多样性，利用LEfSe分析鉴定差异丰度菌属和菌种，并构建Spearman秩相关微生物互作网络。

三、主要研究结果

3.1 宏转录组概览

研究人员对57份样本进行宏转录组测序，去除宿主相关序列和质量过滤后共获得约652.55 Gb高质量数据，平均每份样本约11.45 Gb，测序碱基质量高（中位Q30 = 92.44%）。组装后共鉴定出6,838,229条转录本和3,010,464个非冗余基因（unigene）。

3.2 胃肠道微生物组成特征

宏转录组测序数据共鉴定出118个门、1810个属和5448个种。在藏猪中，胃部以厚壁菌门（Bacillota）和拟杆菌门（Bacteroidota）为主，空肠中变形菌门（Pseudomonadota）占比较高，大肠（盲肠、结肠和直肠）以拟杆菌门和厚壁菌门为主。属水平上，胃部以乳杆菌属（Lactobacillus）和假单胞菌属（Pseudomonas）为主，空肠以梭菌属（Clostridioides）、埃希氏菌属（Escherichia）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）和沙门氏菌属（Salmonella）为主，大肠各部位均以普雷沃氏菌属（Prevotella）为主。种水平上，空肠的优势种包括艰难梭菌（Clostridioides difficile）、大肠杆菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）和肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）。值得注意的是，有尾噬菌体纲（Caudoviricetes）sp.在两组猪的大肠三个部位均为优势种，提示噬菌体可能在猪大肠中发挥重要作用。黑猪的胃肠道微生物组成模式与藏猪大体相似，表明胃肠道部位的空间组织是决定微生物群落结构的主要因素。β多样性分析显示样本主要按胃肠道部位聚类，胃、空肠和大肠之间存在明显分离，但盲肠、结肠和直肠之间无显著差异。

3.3 微生物多样性差异

α多样性分析显示，藏猪和黑猪的胃肠道微生物多样性存在部位特异性差异。黑猪胃部的ACE指数和Chao1丰富度显著高于藏猪，而藏猪直肠的ACE指数和Chao1值显著高于黑猪。空肠的Simpson多样性指数在黑猪中显著高于藏猪。

3.4 微生物通路差异

共鉴定出458个KEGG三级通路，归属于46个二级类别。藏猪和黑猪之间共发现69个差异丰度通路，主要涉及代谢相关功能，包括能量代谢、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢、外源物质降解和代谢以及聚糖生物合成和代谢。在40个差异表达的代谢相关通路中，约69%通过胃部的配对比较鉴定。藏猪胃部有4个能量代谢通路、5个碳水化合物代谢通路、8个氨基酸代谢通路和1个核苷酸代谢通路显著富集，包括淀粉和蔗糖代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、丁酸代谢，以及半胱氨酸和蛋氨酸代谢、精氨酸生物合成、亮氨酸和异亮氨酸生物合成等。此外，藏猪肠道中脂肪消化吸收和聚糖降解等通路也上调。

3.5 微生物群落组成差异

共鉴定出79个在藏猪和黑猪之间显著差异丰度的菌属，每个胃肠道部位有14至19个差异菌属。在肠道（空肠、盲肠、结肠和直肠）中鉴定出的44个差异菌属中，绝大多数（40个，约91%）在藏猪中相对丰度更高。藏猪富集的菌属中75%表现出部位特异性差异。有8个菌属在藏猪大肠三个部位均富集，包括乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和巨球型菌属（Megasphaera），这些菌属均参与SCFAs合成，可能有助于藏猪在高海拔恶劣环境中提高能量利用效率。乳杆菌属和双歧杆菌属还是最常用的益生菌属，可改善肠道屏障功能并增强免疫能力，其在藏猪中更高的相对丰度可能有助于解释藏猪更强的抗病能力。种水平上，藏猪在大多数肠道部位具有更多相对丰度显著升高的菌种，尤其在盲肠中。卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）在藏猪胃和盲肠中丰度更高，而德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）在结肠和直肠中丰度更高。相关性分析显示，藏猪富集的多个菌属之间呈显著正相关，包括乳杆菌属和巨球型菌属。网络分析表明，藏猪胃肠道微生物组比黑猪更复杂（节点数：83 vs. 71；边数：1012 vs. 782）。

3.6 CAZyme编码基因表达差异

共检测到407个CAZyme家族（17个AA、89个CBM、19个CE、156个GH、96个GT和30个PL），GH和GT是两组猪胃肠道中最丰富的两类。藏猪和黑猪之间共有93个CAZyme家族在至少一个部位配对比较中存在显著表达差异，其中57个在藏猪部位中丰度更高，GH类差异数量最多。差异表达的CAZyme家族在藏猪大肠中更丰富（盲肠：16个上调 vs. 0个；结肠：10个 vs. 4个；直肠：22个 vs. 1个），但在胃和空肠中未呈现此趋势。CBM32家族（结合LacNAc）和GH27家族（α-半乳糖苷酶模块）在藏猪大肠三个部位均上调。

四、讨论与结论

本研究发现藏猪胃部微生物群中厚壁菌门和拟杆菌门的丰度显著高于黑猪，厚壁菌门可能与宿主脂肪沉积有关，拟杆菌门能有效分解碳水化合物，与藏猪耐受粗饲料的能力一致。藏猪肠道中显著富集的乳杆菌属和普雷沃氏菌属与既往宏基因组研究结果一致，此外还鉴定出链球菌属（Streptococcus）和副拟杆菌属（Parabacteroides），这些菌属与能量代谢和肠道稳态调节密切相关。藏猪肠道微生物网络更复杂，可能有助于其适应高海拔环境胁迫。卷曲乳杆菌和德氏乳杆菌两种有益菌种在藏猪中富集，可能部分解释了藏猪的高抗病性。藏猪胃部多种代谢通路显著富集，符合高海拔哺乳动物需要更多能量的特征，胃部微生物群可能通过快速合成和转化氨基酸帮助藏猪提高营养利用效率。藏猪肠道中脂肪消化吸收和聚糖降解通路的富集，以及大肠中CAZyme基因表达水平显著升高，表明其大肠微生物群可能具有更高的复杂碳源利用能力，其中CBM32和GH27家族表达上调可能增强微生物识别特定糖链和水解α-半乳糖苷底物的能力，这可能是藏猪应对高原高纤维低营养环境的适应策略之一。

研究结论：本研究揭示了高海拔藏猪与低海拔黑猪之间胃肠道微生物组成和转录功能的差异。卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）和德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）在藏猪胃肠道微生物群中相对丰度更高。藏猪中与能量、碳水化合物、氨基酸和核苷酸代谢相关的微生物通路更为丰富，同时CBM32和GH27 CAZyme家族丰度更高。这些微生物和功能特征与高海拔藏猪相关，可能与其在高海拔条件下的营养利用和能量代谢有关。然而，由于本研究为观察性研究，这些关联并不能证明所鉴定的微生物特征对高海拔适应具有因果贡献，需要进一步的对照实验和功能验证来确定它们在此过程中的作用。