珍珠岩固定化链霉菌生物膜在温室条件下建立持久根际种群并促进绿豆（Vigna radiata）生长

《Microbiology Research》：Perlite-Immobilized Streptomyces Biofilms Establish Persistent Rhizosphere Populations and Promote Mung Bean (Vigna radiata) Growth Under Greenhouse Conditions

　　

摘要翻译：
链霉菌属（Streptomyces spp.）是根际中丰富的放线菌，以其生物防治和植物促生（plant growth-promoting, PGP）能力而闻名。然而，其作为基于生物膜的生物肥料的应用潜力，以及利用惰性载体进行制剂化的研究仍十分有限。本研究旨在筛选具有强生物膜形成能力的促生放线菌菌株，在农业惰性载体珍珠岩（perlite）上诱导其形成生物膜，并在温室条件下评估其对绿豆（Vigna radiata）生长的影响。研究人员从有机鳄梨（Persea americana）果园根际分离的41株放线菌中，通过结晶紫（crystal violet, CV）微量板测定法、滑动试验（sliding test, ST）和刚果红琼脂（Congo Red agar, CRA）法筛选其PGP特性和生物膜形成能力。CV测定显示30 °C为生物膜发育的最适温度，结合CV-ST-CRA结果鉴定出若干高产生物膜菌株。根据一致的生物膜表现和PGP特性，研究人员选取了3株链霉菌（Streptomyces）菌株（ARI_A20-3、ARI_A20-5、ARI_A30-32），其16S rRNA序列分别鉴定为S. aff. flaveolus、S. aff. aureus和S. aff. griseorubens。在珍珠岩上诱导其生物膜，并通过明视野显微镜和扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）进行表征，结果证实形成了成熟、致密的生物膜，覆盖并穿透了矿物表面。在温室条件下，将珍珠岩基生物膜接种剂施用于经灭菌土壤中生长的绿豆，并添加生物炭。单菌株处理ARI_A20-5（T2）和双菌株处理ARI_A20-3与ARI_A30-32（T5）使植物生物量增幅最大，总干生物量分别达到未接种对照的约10.6倍和7.6倍，根干生物量分别达到4.9倍和4.1倍。根际活菌计数显示，在12周内链霉菌CFU增加了1–2个数量级；收获后SEM证实了持久定殖，珍珠岩上存在孢子，根表面及根内存在根际/内生菌丝。这些结果表明，珍珠岩固定化链霉菌生物膜能够在绿豆根际建立持久种群，并在温室条件下显著提高植物生物量（相对于未接种对照），支持其进一步开发为基于载体的接种剂，并推动货架期和田间评价研究。

论文解读文章：
现代农业日益依赖微生物接种剂以提高作物生产力并减少对合成肥料和农药的依赖。然而，这些产品在田间的表现仍高度可变，尤其是链霉菌属（Streptomyces）等放线菌，其作为生物肥料的应用潜力相对其作为生物防治剂的成熟角色而言尚未被充分利用。现有制剂大多基于浮游细胞或孢子，存在货架期有限、施用后存活率低、根际和根表面定殖不稳定等问题，限制了其农艺效果和种植者的采用。同时，缺乏利用链霉菌天然生物膜形成能力的优化载体系统和制剂策略，尽管已知生物膜生长能增强微生物对环境胁迫的耐受性和在土壤中的持久性。这一空白在豆科作物（如绿豆Vigna radiata）中尤为明显。
放线菌是革兰氏阳性、丝状细菌，能形成广泛的营养菌丝和气生菌丝，从而定殖土壤颗粒和植物根部，并在多种陆地和水生环境中降解复杂有机底物。链霉菌属因其合成抗生素、抗氧化剂、抗癌剂和工业酶的能力而尤为突出，同时许多菌株栖息于根际，发挥生物防治和植物促生作用。此前研究中，链霉菌主要被用作生物防治剂源，其作为生物肥料和植物促生菌的潜力直到最近才受到系统关注。已有研究表明，部分链霉菌菌株可通过产生吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid, IAA）、分泌铁载体和溶解磷酸盐等机制显著改善小麦、玉米、豆类、番茄等作物的萌发、营养生长和产量。然而，关于放线菌门中生物膜形成的研究仍不充分，链霉菌胞外基质组成和调控机制的信息有限。生物膜是嵌入自产胞外基质中的结构化微生物群落，相比浮游细胞具有显著增强的环境胁迫耐受性和表面持久性。链霉菌生物膜由营养菌丝和气生菌丝组成的丝状网络嵌入富含蛋白质的胞外基质中，与许多其他细菌以多糖为主的基质不同。chaplins和rodlins等组分组装成rodlet层，有助于表面疏水性和粘附。载体是微生物接种剂技术的重要组成部分，珍珠岩是一种轻质、多孔、化学惰性且经济的膨胀火山玻璃，可提供较大的微生物定殖表面积并保持水分，有助于缓冲干燥和温度波动。既往研究已表明珍珠岩可支持有益细菌（包括链霉菌）生物膜的发育，且生物膜化的珍珠岩接种剂可提高微生物存活率和植物生长。研究人员前期研究证明珍珠岩固定化链霉菌生物膜可改善普通小麦的存活和促生效率，但该制剂策略是否对豆科作物有效尚未验证。本研究将工作扩展到绿豆，并解决前人未涉及的问题：整个温室生长周期内的持续根际定殖、收获时接种菌株的分子验证、多菌株在珍珠岩上的兼容性，以及植物生长响应是否独立于根瘤菌固氮共生。
本研究的目的是：(i)从有机鳄梨园根际筛选具有促生特性和生物膜形成能力的放线菌菌株；(ii)在惰性农业载体珍珠岩上诱导所选链霉菌菌株形成稳定生物膜；(iii)在温室条件下评估珍珠岩基链霉菌生物膜接种剂对绿豆生长和生物量的影响。研究人员假设珍珠岩固定化链霉菌生物膜接种剂能在12周温室试验中维持接种菌株的根际种群，并显著增加绿豆总干生物量和根干生物量。
主要关键技术方法包括：从墨西哥米却肯州有机鳄梨园根际分离41株放线菌，并通过经典形态学和生化试验鉴定；采用结晶紫（CV）微量板法、滑动试验（ST）和刚果红琼脂（CRA）法筛选生物膜形成能力，在25 °C和30 °C两种温度下评估；基于生物膜和促生特性选取3株链霉菌，经16S rRNA基因测序鉴定为S. aff. flaveolus（OP364748）、S. aff. aureus（OP364749）和S. aff. griseorubens（OP364750）；在珍珠岩载体上于30 °C、120 rpm条件下诱导生物膜10天，随后静置培养4–8天，通过明视野显微镜和扫描电子显微镜（SEM）在诱导第3、7、14天表征生物膜形成；温室盆栽试验采用灭菌侵蚀土壤，添加鳄梨生物炭，共7个处理（T1–T7）和3个无接种对照（C0、C1、C2），每处理5次重复，每盆1粒种子，接种浓度约10⁶ CFU/盆，生长12周；在0、6、12周通过平板计数法测定根际活菌数，收获后通过16S rRNA基因再测序确认菌株身份；根段经表面灭菌后通过平板分离和SEM检测内生定殖。
研究结果：
（1）生物膜形成潜力筛选：CV测定显示30 °C为生物膜发育最适温度，更多菌株在该温度下达到与阳性对照（Nocardia brasiliensis NBC2）相当的生物膜量。4株菌（ARI_A20-1、ARI_A20-2、ARI_A20-3、ARI_A20-5）在25 °C和30 °C均为一致的高产生物膜菌株。ST试验中，21/41株在两种温度下被分类为高产生物膜（HP）或良好产生物膜（GP），且30 °C下扩展直径更大。CRA试验将菌株分为NP、GP、HP三类，未观察到温度差异。综合三种方法，ARI_A20-3和ARI_A20-5表现最一致，ARI_A30-32因PGP特性突出而被保留。
（2）珍珠岩上生物膜诱导：SEM显示所选菌株在珍珠岩表面形成成熟生物膜。ARI_A20-3在第14天形成致密生物膜并穿透矿物表面；ARI_A20-5在第3天即出现菌丝附着和第7天胞外基质覆盖，第14天生物膜完全成熟并渗入孔隙；ARI_A30-32扩散较慢，第14天形成多层堆叠的成熟生物膜。对照菌株ARI_A7-3未形成成熟生物膜。
（3）温室植物试验：与未接种对照相比，T2（ARI_A20-5单菌株）和T5（ARI_A20-3 + ARI_A30-32）显著提高了植株高度、总干生物量和根干生物量。T2总干生物量约为对照的10.6倍，T5约为7.6倍；根干生物量分别为4.9倍和4.1倍。叶片数无显著差异。统计采用Tukey–Kramer和Dunnett多重比较，三个对照间无显著差异。
（4）根际种群动态：在12周内，多数处理根际可培养链霉菌CFU较初始接种量增加1–2个数量级，达到约10⁹ CFU/g根际土。收获后对代表性菌落进行16S rRNA测序，结果与初始接种菌株序列一致，确认回收菌株为接种的链霉菌，而非污染物或土著菌。
（5）收获后SEM和内生定殖：收获后珍珠岩表面观察到大量孢子，表明生物膜在根际环境中发生了从生物膜到孢子的转变。在三菌株处理（T7）中，SEM清晰显示三种不同形态的孢子共存，证实了菌株在混合生物膜状态下的兼容性。根内生定殖检测仅在T2（ARI_A20-5）中观察到菌丝侵染根组织，其他处理未检测到内生菌丝，但T1和T3–T7仍表现出显著的植物生长促进效应，表明根际层面的促生机制（如IAA产生、溶磷、铁载体分泌）在该系统中独立于内生定殖发挥作用。
讨论部分：本研究中T2和T5的生物量增幅远大于文献中链霉菌PGPR通常报道的+20%至+100%的范围，这归因于灭菌土壤中缺乏土著微生物竞争、低基础肥力造成的对照基线较低、多机制PGP同时作用、根际种群持续维持以及接种剂与种子直接接触等因素。与非灭菌条件下的田间表现相比，这些倍数变化应谨慎解释。多菌株处理中仅T5显著高于其组成单菌株处理，表明混合菌株效应并非简单相加。珍珠岩载体和生物膜结构为菌株提供了保护，有助于持久存活。孢子形成可能是维持12周高活菌数的机制。生物膜到孢子的转变和珍珠岩的物理化学稳定性暗示制剂可能具有较长货架期，但需直接实验验证。内生定殖的菌株特异性提示宿主-菌株识别信号的存在，具体分子机制尚待表征。
研究结论：本研究证明将促生链霉菌菌株以生物膜形式固定于珍珠岩上，可增强其在温室条件下绿豆根际的持久性和促生效果。多标准筛选（CV、ST、CRA）鉴定出3株具有稳定生物膜形成能力的菌株：S. aff. flaveolus、S. aff. aureus和S. aff. griseorubens。在珍珠岩上，这些菌株在14天内形成穿透载体多孔基质的成熟生物膜。施用于灭菌土壤后，单菌株处理ARI_A20-5（T2）和双菌株处理ARI_A20-3与ARI_A30-32（T5）产生最大生物量增益，总干生物量分别达未接种对照的10.6倍和7.6倍。这些效应伴随持续的根际定殖：活菌数增加1–2个数量级，并在第12周通过16S rRNA再鉴定确认为接种菌株。由于这些响应发生在无菌根瘤菌的灭菌土壤中，它们反映的是直接的促生机制，而非对根瘤菌共生的调节。收获后分析显示，到第12周生物膜已大量转变为孢子为主的种群，为持续根际存活提供了机制基础。在三菌株处理中，SEM证实了接种菌株在珍珠岩上的共存，表明混合菌株生物膜状态的兼容性，但三菌株制剂的生长响应未超过T2或T5。内生定殖仅在T2中被一致观察到，但未检测到内生定殖的处理仍表现出显著生长响应，表明根际层面的互作足以驱动该系统内的植物促生作用。总体而言，这些发现确立珍珠岩固定化链霉菌生物膜作为豆科作物有效载体接种剂形式。向非灭菌田间条件转化、扩展至其他豆科寄主、评估货架期及对土壤微生物群落结构的长期影响，以及与相同菌株的浮游和纯孢子制剂进行直接对比，是下一阶段研究的关键方向。