钝顶螺旋藻藻蓝蛋白C在填充床色谱中动态结合容量的预测性优化与放大研究

《Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers》：Predictive optimization and scale-up of dynamic binding capacity for C-phycocyanin from Spirulina platensis in packed-bed chromatography

　　

摘要
背景
5% 穿透动态结合容量（DBC5%）是填充床色谱中的关键性能参数，因为它决定了吸附剂的有效工作容量，并直接影响动态流动条件下的工艺生产力。

方法
本研究提出了一种系统方法论，用于利用顺序实验设计（DoE）方法对从铜螺旋藻（Spirulina platensis）中提取的藻蓝蛋白（CPC）净化的 DBC5% 进行预测优化和放大。首先采用带有两个中心点的 2? 全因子设计（2? + 2）来识别显著的操作变量，随后采用中心复合设计（CCD）来评估潜在的非线性响应。

主要发现
2? + 2 因子模型表现出优越的预测性能，R2 达到 98.97%，预测 R2 为 94.82%，而 CCD 模型对应的数值分别为 91.04% 和 48.50%。优化后的操作条件（pH 6.0，进料浓度 10% (w/v)，床层高度 1.6 cm，流速 10.0 mL/min）得出的预测 DBC5% 为 10.51 mg/mL，实验观测值为 10.45 mg/mL 验证了这一预测，相对误差为 2.9%。此外，在保持流体动力学相似性的情况下，将放大从 1.6 cm 内径柱扩展到 5.0 cm 内径柱，成功保持了 DBC5%，证明了在所研究的尺度范围内吸附性能的一致性。尽管开发的回归模型专用于所研究的色谱系统，但提出的基于 DoE 的优化框架和流体动力学放大策略提供了一种实用方法，经过适当的实验校准和验证后，可应用于其他填充床色谱系统。

1. 引言
藻胆蛋白是蓝细菌的主要光合色素，铜螺旋藻（Spirulina platensis）是藻蓝蛋白（CPC）的重要来源 [[1], [2], [3]]。CPC 是一种天然蓝色素，应用于化妆品、诊断和治疗领域 [4,5]。已开发多种 CPC 回收纯化方法，包括硫酸铵沉淀 [6]、双水相萃取 [2,4,7]、膜分离 [8]、离子交换色谱 [4,9,10] 和亲和色谱 [11]。在这些技术中，离子交换色谱因其高选择性、可扩展性以及工业下游加工兼容性而被广泛用于高分辨率纯化。然而，其性能关键取决于动态操作条件和原料特性。

粗铜螺旋藻提取物除 CPC 外，还含有多种蛋白质、色素、多糖、核酸、脂质和其他细胞衍生物生物大分子，这些物质可能会竞争吸附位点，改变进料粘度，并影响穿透行为和 DBC5%。因此，色谱优化必须考虑目标蛋白质及其周围生物大分子基质的综合影响，而不仅仅是纯化 CPC 的吸附行为。在此背景下，实验设计（DoE）提供了一种实用且系统的方法，通过考虑复杂粗提取物的集体影响，识别在真实进料条件下最大化 CPC 吸附的操作条件。

DBC5% 被广泛认可为评估连续流动操作下色谱吸附性能的实用且具工业意义的指标，因为它代表了在发生显著产品损失之前可用的结合容量 [[12], [13], [14], [15]]。与静态吸附容量不同，DBC5% 纳入了流体动力学、轴向分散、传质、吸附动力学和停留时间的综合影响，从而为动态操作条件下的柱性能提供了现实评估 [16,17]。在蛋白质色谱中，5% 的穿透标准通常被采用，因为它确保约 95% 的目标蛋白质保留在吸附剂中，同时最小化样品加载期间的产品损失。因此，DBC5% 作为工艺优化、树脂评估和色谱放大的重要设计参数。对于从铜螺旋藻裂解液中纯化 CPC 而言，DBC5% 尤为关键，因为过早穿透会降低产品回收率，限制柱生产力，并增加下游加工成本 [18,19]。

由于 DBC5% 受多个相互影响的操作变量支配，并受到粗进料基质复杂性的强烈影响，因此需要进行系统优化以识别最大化色谱性能的操作条件。在此背景下，DoE 提供了一个实用且高效的框架，用于评估操作变量的综合影响，同时考虑在真实工艺条件下复杂生物大分子基质的集体影响 [20]。DBC5% 受多个相互作用参数的影响，包括进料浓度 (C?)、pH、床层高度 (H)、流速 (F) 和进料流变性。例如，增加 C? 会增强浓度驱动力，但也会增加粘度，降低传质效率。此类多变量相互作用无法使用单因素轮换法可靠优化 [[21], [22], [23], [24]]。DoE 已成为系统优化的标准 [[25], [26], [27], [28], [29]]。全因子 (2?) 设计允许高效筛选线性效应和交互作用 [30]。带有中心点 (2? + center) 的设计可使用 Ct Pt 项评估曲率 [31,32]。显著曲率 (p < 0.05) 表明非线性行为，暗示线性建模可能不充分。当确认存在曲率时，响应面方法 (RSM) [33,34]，特别是 CCD，能够估计二次效应并建模局部最优值 [[35], [36], [37], [38], [39]]。CCD 在因子点之外增加了轴向点 (±α) 和重复中心点，允许构建二阶响应面。

然而，模型充分性评估必须超越拟合优度 [40]。高的决定系数 (R2) 并不意味着预测可靠性。必须考虑调整 R2、预测 R2、残差误差平方和预测值 (PRESS) 统计量以及失拟检验，以避免过拟合 [41,42]。R2 与预测 R2 之间的巨大差距表明参数过多。还必须纳入工程约束。对于铜螺旋藻裂解液，增加浓度理论上可增加 DBC5%，但升高的粘度和不完全的细胞破碎会降低有效结合。此外，压力降限制，由 Ergun 方程描述 [43]，限制了流速和进料浓度。在放大期间，必须维持流体动力学相似性，特别是表观流速 (u) 和床层高度与直径之比 (H/D) [44]。在放大柱直径时，建议保持恒定的表观流速而不是恒定的体积流量 [45]。

基于普通微分方程或偏微分方程的实验设计 (DoE) 和机理模型在色谱工艺开发中起互补作用。机理色谱模型通过描述溶质迁移的耦合质量平衡、吸附动力学、轴向分散、外膜传质和颗粒内扩散，提供对吸附和传输现象的基本理解。然而，其成功应用需要可靠的吸附等温线参数估计、动力学常数、扩散系数、轴向分散系数和其他物理化学性质，这些对于含有多个相互作用生物大分子的复杂生物原料通常难以获得 [21,25]。相比之下，DoE 提供了一种实用、数据驱动的工艺优化框架，通过统计回归经验建模操作变量与工艺响应之间的关系。它使用相对少量的实验，无需详细的机理参数，即可同时评估多个因素及其相互作用，识别显著变量，并量化预测不确定性 [[26], [27], [28], [29]]。因此，本研究采用 DoE 开发 DBC5% 的预测模型并优化色谱操作条件，而不是提供色谱系统的完整机理表示。因此，机理方法和统计方法应被视为互补而非竞争的方法：机理模型提供传输级见解和色谱过程的预测模拟，而 DoE 为实验筛选、工艺优化、预测模型验证和流体动力学放大提供了高效框架，在定义的操作域内有效。

因此，本研究的目的是开发并实验验证一个预测框架，用于使用顺序 DoE 策略优化从粗铜螺旋藻提取物中纯化 CPC 的填充床过程中的 DBC5%。首先采用带有中心点的 2? 因子设计来识别显著的操作变量、交互作用和潜在响应曲率，随后采用 CCD 评估非线性响应并构建二阶模型。使用 R2、调整 R2、预测 R2、PRESS 和失拟检验系统地评估模型充分性 [46]。随后通过实验验证优化后的操作条件，并在流体动力学相似条件下评估不同柱直径下的性能。尽管 resulting 回归方程专用于所研究的原料、树脂、柱配置和操作范围，但因子筛选、预测模型验证和流体动力学放大的整体工作流程提供了一套可转移的框架，用于经过适当系统特定校准后的色谱工艺开发。

本工作的新颖性在于将因子筛选、CCD 建模、预测模型验证和流体动力学放大整合到一个统一的统计 - 工程框架中，用于在真实操作约束下优化 DBC5%。与主要依赖 R2 作为模型性能衡量标准的传统研究不同，本研究系统地比较了一阶和二阶模型，使用预测统计标准，包括调整 R2、预测 R2、PRESS、残差分析和失拟检验，以最小化过拟合风险。此外，明确考虑了与增加生物量浓度相关的粘度诱导操作约束，认识到其对进料流变性、传质和色谱性能的影响。通过将预测统计建模与基于工程的放大原则相结合，本研究提供了一种稳健且经过实验验证的方法，用于优化 DBC5%，同时确保预测可靠性、实际可扩展性和工业相关性。

2. 材料与方法
2.1. 材料与设备
本研究使用的 STREAMLINE DEAE 吸附剂（100–300 μm，1.2 kg/m3）购自 GE Healthcare Biosciences（瑞典乌普萨拉）。干燥铜螺旋藻粉购自 Charming & Beauty Co., Ltd.（中国台湾台北）。所用其他所有化学品均为分析纯。细胞破碎使用超声波处理器（Misonix Model S-4000, Sonics & Materials, Inc., Newtown, CT）进行。使用紫外 - 可见分光光度计（Ultrospec 3100 pro, GE Healthcare Biosciences, 瑞典乌普萨拉）测量蛋白样品的吸光度。?KTA Explore 色谱系统购自 GE Healthcare Biosciences（瑞典乌普萨拉）。Watson-Marlow 蠕动泵（Model 302S）购自 Watson-Marlow Ltd.（英国法尔茅斯）。所有实验室规模优化和穿透研究使用了内径 (ID) 分别为 1.6 cm、2.6 cm 和 5.0 cm 的 XK 16/20、26/20 和 50/20 柱（Cytiva）。每根柱配备了可调节适配器，允许精确控制床层高度，同时确保填充树脂表面上的均匀流动分布。

2.2. 超声细胞破碎
在圆柱形容器（6.0 cm 内径，15.0 cm 高度）中对 100 mL 10% (w/v，干重基础) 铜螺旋藻细胞悬浮液进行超声处理。20 kHz 超声探头（直径 13 mm，长度 127 mm）在 4 °C 下以 20–100% 声学强度输送能量 20 分钟。超声能量采用脉冲模式（60 秒活动，60 秒停止）。破碎期间样品保持在冰浴中以防止过热。细胞破碎性能以释放的 CPC（mg/mL）评估。

2.3. 分析方法
使用紫外 - 可见分光光度计在 280、615 和 652 nm 波长下测量 CPC 浓度。溶液中 CPC 的浓度通过 615 和 652 nm 处的吸光度测量并使用以下公式计算 [47,48]：
(1) CPC (mg/mL) = (A615 ? 0.474 × A652) / 5.34

2.4. 穿透定义与 DBC 测定
动态结合容量通过前沿分析确定 [49]。DBC5% 定义为流出液浓度达到入口浓度 5%（C/C? = 0.05）时的加载体积，这是确定色谱吸附剂可用动态结合容量的广泛接受标准。选择 DBC5% 作为主要响应是因为它反映了连续流动操作下柱的有效工作容量，同时最小化样品加载期间的产品损失。因此，本研究在整个工艺优化过程中使用 DBC5% 作为响应变量。
CPC 的 DBC5% 计算如下：
(2) DBC5% = (V5% ? Vsystem) / Vbed × C0
其中 V5% 是沉降床体积，C0 是进料 CPC 浓度 (mg/mL)。穿透实验进行两次重复，报告值为平均值。系统死体积 (0.45 mL) 来自进样阀、柱入口和紫外检测器之间的 tubing、流动池和连接器，通过将柱替换为零体积连接器并注射示踪剂脉冲来确定。从所有穿透体积中减去此体积以确保准确计算柱特定结合容量。所有实验在环境实验室温度 (25 ± 2 °C) 下进行，并在整个实验过程中监控以确保所有运行的一致性。

2.5. 因子实验设计 (2? + 中心点)
使用二水平因子设计来评估关键参数对利用离子交换色谱法进行藻蓝蛋白 DBC5% 的影响，该方法已被证明对从藻类生物质中纯化藻蓝蛋白有效 [48]。选择了四个独立变量：pH (X?)、进料浓度 (C?, X?)、床层高度 (H, X?) 和流速 (F, X?)。
由于实验范围不同（表 1），因子水平被转换为无量纲编码值 (?1 到 +1)。

该设计采用了 2? 部分因子方案，并包含两个重复的中心点，共 18 组实验，可评估主效应和两因子交互作用（pH × C?、pH × H、pH × F、C? × H、C? × F、H × F）。实验顺序随机化以降低偏差，并选取部分条件进行重复以评估可重复性。

**表 1. 用于评估 pH（X?）、进料浓度（C?，X?）、床层高度（H，X?）和流速（F，X?）对藻蓝素动态结合容量影响的因子设计中，实验变量及编码水平。** 编码水平（?1、0、+1）分别对应实验中使用的低、中和高操作值。

| 变量 | 主要因子 | 编码水平 | | | | |
|------|----------|----------|---|---|---|---|
| | | ?1（低） | 0（中） | +1（高） | | 对应操作值 |
| X? | pH | 7 | | | | 8 |
| X? | C?（%，w/v） | 1 | | | | 5.5 | 10 |
| X? | H（cm） | 1.6 | | | | 10.4 | 19.2 |
| X? | F（mL/min） | 1.6 | | | | 5.8 | 10 |

中心点实验（第 16 组和第 18 组）使用中点值以估算纯误差并检验曲率。完整的因子矩阵见补充信息（表 S1）。

### 2.6 中心复合设计（CCD）

基于因子实验结果，DBC 的最佳区域已在所考察范围内；因此，无需进行最速上升实验。为提高预测精度并考察非线性关系，采用 CCD 构建 DBC?% 的二阶预测模型。

CCD 利用原始因子点、轴向（星形）点和重复中心点扩展了设计空间，可估算二次效应和曲率。包含四个自变量：pH（X?）、进料浓度（C?，X?）、床层高度（H，X?）和流速（F，X?），每个变量设五个编码水平（?2、?1、0、+1、+2）（表 2）。部分计算所得轴向水平对应物理上不可达的条件，故采用最小可达值。

**表 2. 用于评估 pH（X?）、进料浓度（C?，X?）、床层高度（H，X?）和流速（F，X?）对藻蓝素动态结合容量影响的 CCD 中所用编码水平及对应操作值。** CCD 包含五个编码水平（?2、?1、0、+1、+2），以估算二次响应面。

| 自变量 | 编码水平 | | | | | 对应操作值 |
|--------|----------|---|---|---|---|
| | ?2 | ?1 | 0 | +1 | +2 | |
| pH | 5 | | 6 | | 7 | | 8 | | 9 |
| C?（%，w/v） | 1 | | 3.25 | | 5.5 | | 7.75 | | 10 |
| H（cm） | 1.6 | | 6 | | 10.4 | | 14.8 | | 19.2 |
| F（mL/min） | 1.6 | | 3.7 | | 5.8 | | 7.9 | | 10 |

初步实验表明，生物质浓度超过 10%（w/v）会导致过度粘性和细胞破碎不完全。尽管 CCD 中包含 14.5%（w/v）的轴向水平，但所有实际操作实验均限制在 10%（w/v）以保证可重复性。

CCD 共包含 31 组实验（表 S2），包括因子点、轴向点和七个重复中心点。该设计可分析主效应和两因子交互作用（pH × C?、pH × H、pH × F、C? × H、C? × F、H × F）。实验顺序随机化以降低偏差。利用 ANOVA、系数显著性检验、R2、调整 R2、预测 R2 及残差诊断对二次模型进行评估。完整的 CCD 矩阵见表 S3、S4。

### 2.7 优化操作条件下的纯化

为验证优化操作条件下的纯化性能，采用直径 1.6 cm 的填充床柱在 2? + 2 因子模型预测的最优条件下（pH 6.0、10%（w/v）粗制螺旋藻提取物、床层高度 1.6 cm、恒定表观流速 50 cm/h）进行色谱纯化。约 3.7 mL 粗提取物（CPC 浓度：9.05 mg/mL）被载入柱中，对应实验测定的 DBC?%。载样后，以相同表观流速用 20 mM 磷酸缓冲液（pH 6.0）洗柱，直至紫外吸光度回归基线。随后在维持相同表观流速（50 cm/h）的同时，使用 20 mM 磷酸缓冲液（pH 6.0）中的 0.6 M NaCl 洗脱所结合的 CPC，在吸附、洗涤和洗脱各阶段均保持恒定表观流速以确保流体力学条件一致。对收集到的各组分（包括粗提取物、流穿液和洗脱组分）进行 SDS-PAGE 分析，以验证优化操作条件下的 CPC 纯化效果。

### 2.8 放大方法

放大实验采用经 2? + 2 因子模型验证的最优操作条件。进料液为 10%（w/v）粗制螺旋藻提取物，对应 CPC 浓度为 9.05 mg/mL。分别评估内径为 1.6、2.6 和 5.0 cm 的填充床柱，同时保持床层高度恒定为 1.6 cm。

通过维持恒定表观流速（50 cm/h）、恒定床层高度（1.6 cm）和恒定停留时间实现流体力学相似性，这是填充床色谱中被广泛接受的放大原则 [44,45]。据此，根据柱截面面积调整体积流量，同时保持相同表观流速。1.6、2.6 和 5.0 cm 内径柱对应的流速分别为 1.68、4.42 和 16.36 mL/min。同样，载样体积按柱截面面积成比例放大，1.6、2.6 和 5.0 cm 柱的载样体积分别为 3.70、9.77 和 36.13 mL 粗提取物。该放大策略在所有柱尺寸上保持了相同的停留时间和流体力学条件，从而为比较穿透行为和色谱性能提供了统一基准 [44,45]。

载样后，每根柱均以相同表观流速用 20 mM 磷酸缓冲液（pH 6.0）洗涤，直至紫外吸光度回归基线。随后在维持相同表观流速（50 cm/h）的同时，使用 20 mM 磷酸缓冲液（pH 6.0）中的 0.6 M NaCl 洗脱所结合的 CPC，在吸附、洗涤和洗脱各阶段均保持恒定表观流速。

### 2.9 模型评估的统计标准

采用多种统计标准评估模型的预测性能和适用性。决定系数（R2）评估总体拟合优度，调整 R2 则考虑了模型参数数量。预测 R2 评估对新观测值的预测能力。PRESS 统计量用于量化预测误差和模型鲁棒性。采用赤池信息准则（AIC）和贝叶斯信息准则（BIC）[50] 进一步考察模型简约性和比较性能，其中较低值表明在降低复杂度的同时具有更好的预测可靠性。这些指标用于系统比较因子模型和 CCD 模型，并确定 DBC?% 最可靠的预测模型。

## 3. 结果与讨论

### 3.1 因子设计（2? + 中心点）的筛选结果

采用含中心点的两水平因子设计（2? + 2）筛选 pH、进料浓度（C?）、床层高度（H）和流速（F）对 DBC?% 的影响。实验矩阵及对应的 DBC?% 值汇总于表 S3。测得的 DBC?% 值范围为 0.412 至 10.335 mg/mL，表明所选变量对吸附性能有显著影响。

初步分析表明，C? 和 H 对 DBC?% 的影响最大，而 pH 和 F 的贡献较小。观察到若干交互效应，其中 pH × F 交互作用高度显著（p < 0.001），说明流速对 DBC?% 的影响强烈依赖于 pH。

重复中心点实验（第 16 组和第 18 组）的引入使得对潜在曲率的评估成为可能。中心点 DBC?% 值（2.165 和 2.333 mg/mL）与线性因子模型预测的响应值（2.249 mg/mL）存在偏差，曲率项（Ct Pt）具有统计显著性（p = 0.008），证实了操作变量与 DBC?% 之间的关系并非严格线性。

因此，随后实施 CCD 以实现二阶响应面建模，并进一步细化最优操作条件的预测。

### 3.2 工艺变量对 DBC?% 的主效应和交互效应

利用主效应图、交互效应图和 Pareto 图（图 S1–S3）分析了 pH（A）、进料浓度（B）、流速（C）和床层高度（D）对 DBC?% 的影响。主效应图（图 S1）显示，进料浓度产生最强的正向影响；浓度从 1% 增加至 10%（w/v）时，通过增强吸附驱动力显著提高了 DBC?%。相比之下，床层高度表现出强烈的负向效应；床层高度从 1.6 cm 增至 19.2 cm 时，DBC?% 大幅降低，这可能是由于轴向分散增加所致。pH 和流速的影响较小。

交互效应图（图 S2）揭示了 pH 与流速之间存在显著的耦合作用，表明流速效应强烈依赖于 pH（p < 0.001）。Pareto 图（图 S3）确认进料浓度和床层高度是最显著的因素（均 p < 0.001），而 pH 和流速低于显著性阈值（α = 0.05）。总体而言，C? 和 H 是控制 DBC?% 的主导变量，为后续响应面建模提供了机理性依据。

### 3.3 基于因子设计（2? + 中心点）的模型构建

利用因子实验结果（α = 0.05）建立了描述 DBC?% 的回归模型。统计参数汇总于表 3。该模型表现出优异的拟合效果（R2 = 98.97%，调整 R2 = 98.05%），确认了准确表示且无不必要项。曲率检验（Ct Pt）具有显著性（p < 0.05），为后续 CCD 的应用提供了依据。

编码回归方程为：

(3) DBC?% = 2.249 ? 0.355(pH) + 2.811(C?) ? 0.036(F) ? 1.622(H) ? 0.401(pH×C?) ? 1.379(pH×F) + 1.256(pH×C?×F×H)

本研究所建立的预测回归模型反映的是标准化粗制螺旋藻提取物的色谱行为，而非纯化 CPC 的行为。由于所有实验均使用相同的粗提取物制备，共存的蛋白质、色素、多糖、核酸、脂质及其他生物大分子的竞争效应始终被纳入用于模型开发的实验响应中。因此，优化后的操作条件和回归系数代表了在所考察实验条件下目标蛋白及其周围进料基质共同影响的结果。相应地，该回归模型专属于所研究的粗制螺旋藻提取物和色谱系统。由于螺旋藻株系、培养条件、提取方法或相关生物大分子基质的差异所引起的生物质组成变化，可能会改变吸附行为，从而影响模型的预测性能。因此，将该回归方程应用于其他原料时应伴随适当的实验重新校准和验证。

该模型在预测的最优条件下进行了实验验证（pH 6.0、C? = 10%（w/v）、H = 1.6 cm、F = 10.0 mL/min），预测 DBC?% 为 10.04 mg/mL，与实验测定值 10.335 mg/mL 吻合良好，相对预测误差为 2.85%。这一高度一致性证实了该因子模型在色谱工艺优化和放大方面的稳健性和预测可靠性。

### 3.4 响应面建模的中心复合设计

基于因子筛选结果，DBC?% 的最优区域已在所考察域内；因此，无需进行最速上升实验。为提高预测精度并考察非线性关系，采用 CCD 构建二阶响应面模型。

CCD 通过引入轴向点（2 × k = 8）和额外重复中心点扩展了因子设计，共 31 组实验（16 组因子点、8 组轴向点、7 组中心点）。四个变量——pH（A）、进料浓度（B，C?）、流速（C，F）和床层高度（D，H）——在五个编码水平（?2、?1、0、+1、+2）上进行评估（表 2）。部分计算所得轴向水平对应负物理值，已替换为最小可达值。

进料浓度限制为 10%（w/v），因为更高浓度会导致过度粘性和细胞破碎不完全。完整实验矩阵见表 S4。测得的 DBC?% 值范围为 0.413 至 9.65 mg/mL。

回归分析得出二阶模型，R2 = 91.0%，调整 R2 = 83.2%，预测 R2 = 48.5%，S = 1.065。预测最优条件为 pH 7.0、C? = 14.5%（w/v）、H = 1.6 cm、F = 14.2 mL/min，对应预测 DBC?% 为 11.97 mg/mL。

然而，由于预测 R2 较低（48.5%）且 14.5% 浓度存在实际限制，这些条件未进行实验验证。尽管如此，CCD 成功确定了最大化 DBC?% 的理论最优区域。

### 3.5 基于中心复合设计的模型构建

#### 3.5.1 回归模型与系数分析

利用 CCD 结果建立了二阶多项式模型以描述 DBC?%。估算的回归系数及统计显著性汇总于表 4。

进料浓度（C?）和床层高度（H）是主导因素。C? 具有最大的正系数（β = 4.431，p < 0.001），表明增加进料浓度可通过提高传质驱动力来增强 DBC?%。床层高度表现出强烈的负向线性效应（β = ?2.364，p < 0.001），由于流体力学分散和 MTZ 展宽而降低 DBC?%。

二次项H2具有显著性（p = 0.007），表明存在非线性关系。C? × H交互项高度显著（p = 0.001），且系数为负值（β = ?4.283），说明随着床层高度的增加，浓度产生的正效应逐渐减弱，这是由于停留时间缩短所致。其他因素（pH和流速）及其二次项均不具统计学显著性（p > 0.05），表明曲率主要与床层高度有关。

基于回归系数，编码变量下的二阶多项式模型可表示为：

(4) DBC?% = 2.784 ? 0.002(pH) + 0.093(F) + 4.431(C?) ? 2.364(H) ? 1.025(pH2) + 0.360(F2) + 0.292(C?2) + 2.438(H2) ? 0.551(pH × F) ? 0.233(pH × C?) ? 0.032(pH × H) + 0.305(F × C?) ? 0.815(F × H) ? 4.283(C? × H)

### 3.5.2 方差分析（ANOVA）

采用方差分析评估CCD模型的拟合优度（表5）。该模型的R2 = 91.04%，调整R2 = 83.21%，但预测R2仅为48.50%，明显偏低，提示模型存在过拟合，预测能力有限。PRESS = 104.392表明预测不确定性较大。

表5显示，回归模型具有统计学显著性（F = 11.62，p < 0.001）。线性项高度显著（F = 33.35，p < 0.001），其中C?和H的贡献最大。二次项整体显著（F = 3.03，p = 0.049），其中仅H2单独显著（p = 0.007）。二阶交互项整体显著（F = 2.86，p = 0.043），主要由C? × H驱动（p = 0.001）。失拟项高度显著（F = 274.66，p < 0.001），表明二次模型未能充分捕获响应面。

### 3.5.3 残差诊断

残差诊断（图S4）确认正态性、方差齐性和独立性假设均得到满足。正态概率图显示残差沿直线分布，残差与拟合值图未呈现漏斗形模式，残差与观测顺序图未显示时间依赖性趋势。

### 3.5.4 CCD模型的局限性

尽管CCD模型满足统计学假设，但其预测可靠性较低（预测R2 = 48.50%）。其预测的最优条件（pH 7.0、C? = 14.5% w/v、F = 14.2 mL/min、H = 1.6 cm）位于实验设计空间之外（外推幅度 > 40%）。统计模型无法可靠地预测数据范围之外的结果。此外，由于树脂饱和导致边际收益递减以及黏度增加的影响，14.5% w/v条件下的实际DBC?%可能等于或低于10% w/v条件下的值，这与模型预测的11.97 mg/mL存在偏差。

### 3.5.5 与析因模型的对比

相比之下，析因模型的最优条件（pH 6.0、C? = 10% w/v、F = 10.0 mL/min、H = 1.6 cm）位于经验证的设计空间内，并经实验确认（预测值：10.04 mg/mL；实验值：10.335 mg/mL；相对误差 = 2.9%）。结合其更优的预测性能（预测R2 = 94.82%），析因模型的最优条件被采纳为放大应用的真实工艺最优参数。

### 3.6 因子交互作用的响应面分析

图1、图2、图3、图4、图5和图6中的响应面分析直观展示了pH、进料浓度、流速和床层高度在决定DBC?%方面的交互作用。图1显示进料浓度为主导因素，DBC?%随浓度升高而增加，而pH表现为较弱的反向效应（最优点接近pH 7.0）。图2显示在接近中性的pH条件下，增加流速可提高DBC?%，但在pH > 8时急剧下降。图3揭示较低的床层高度有利于获得较高的DBC?%。图4展示了浓度与流速之间的协同增效作用（预测最大值出现在14.5% w/v和14.2 mL/min处）。图5确认较高的浓度可提高DBC?%，而较高的床层高度则会降低DBC?%。图6表明高流速与低床层高度的组合可获得最佳性能。


**图1.** 在床层高度固定为1.6 cm、流速固定为10 mL/min的条件下，展示pH和进料浓度对DBC?%影响的等高线图和三维响应面图。结果表明，DBC?%随进料浓度升高而显著增加，而pH则表现出相对较弱的反向效应。最高的DBC?%值出现在pH 7和进料浓度14.5%（w/v）附近，表明进料浓度是控制吸附性能的主导因素。


**图2.** 在进料浓度固定为14.5%（w/v）、床层高度固定为1.6 cm的条件下，展示pH和流速对DBC?%交互影响的等高线图和三维响应面图。增加流速可提高DBC?%，尤其在中性pH条件下更为明显。然而，在pH > 8的碱性条件下，DBC?%显著下降，表明吸附亲和力降低以及可能存在蛋白质不稳定问题。最佳操作区域出现在约pH 7和流速14.2 mL/min处。


**图3.** 在进料浓度和流速固定条件下，展示pH与床层高度对DBC?%交互作用的等高线图和三维响应面图。较低的床层高度有利于获得较高的DBC?%值，而增加床层高度会降低吸附性能，这可能是由于传质阻力增加和轴向扩散效应所致。在研究范围内，pH的影响相对较小。最高DBC?%值在pH 7和床层高度1.6 cm处获得。


**图4.** 展示进料浓度和流速对DBC?%组合影响的等高线图和三维响应面图。在高进料浓度和高流速条件下观察到DBC?%的协同增效作用。等高线梯度沿浓度方向更陡，确认进料浓度对吸附性能的影响强于流速。最高DBC?%值在进料浓度14.5%（w/v）和流速14.2 mL/min处实现。


**图5.** 展示进料浓度与床层高度对DBC?%交互作用的等高线图和三维响应面图。增加进料浓度可持续提高DBC?%，而增加床层高度则对吸附性能产生不利影响。最高的DBC?%值在高进料浓度和低床层高度条件下获得，表明浅床层可以改善传质并减少动态吸附过程中的扩散限制。


**图6.** 展示流速与床层高度对DBC?%交互影响的等高线图和三维响应面图。高流速与低床层高度的组合可获得最佳吸附性能。相比之下，增加床层高度或降低流速会显著降低DBC?%，表明传质效率降低以及吸附区利用不够充分。最佳区域位于流速14.2 mL/min和床层高度1.6 cm处。

综合所有图表，进料浓度是主导的正向因素，床层高度是强负向因素，最佳结合发生在pH 6.0–7.0附近（在pH > 8时急剧下降）。CCD模型预测的最优条件为pH 7.0、C? = 14.5% w/v、H = 1.6 cm和F = 14.2 mL/min，预测DBC?%为11.97 mg/mL。然而，这些条件涉及外推（超出设计空间 > 40%），未经实验验证，且CCD模型的预测可靠性较低（预测R2 = 48.5%）。

因此，采用析因模型的已验证最优条件（pH 6.0、C? = 10% w/v、H = 1.6 cm和F = 10.0 mL/min），其经实验确认的DBC?%为10.45 mg/mL，作为真实的工艺最优参数。

### 3.7 优化条件下的纯化性能

为验证2? + 2析因模型预测的优化操作条件下的纯化性能，采用SDS–PAGE对1.6 cm内径填充床色谱柱收集的色谱馏分进行分析（图S5）。粗制S. platensis提取物（泳道1）显示出多条蛋白质条带，反映了进料液的复杂蛋白质组成。相比之下，流穿馏分（泳道2）仅在约17 kDa处显示一条微弱条带，表明在加样阶段大部分CPC被STREAMLINE DEAE吸附剂保留。三个洗脱馏分（泳道3–5）在约17 kDa处显示出明显条带，与CPC α-和β-亚基的分子量一致，且杂蛋白条带显著少于粗提物。这些SDS–PAGE图谱为优化色谱条件下CPC在加样阶段的有效保留及在洗脱馏分中的富集提供了定性证据。

优化后的吸附条件实现了94.3%的捕获效率，而采用0.6 M NaCl在20 mM磷酸缓冲液（pH 6.0）中的固定洗脱方案获得了99.6%的洗脱效率，确认了结合态CPC的高效回收。结合经实验验证的约10.45 mg/mL的DBC?%，这些结果表明优化后的操作条件在实验室规模条件下可提供高效的色谱纯化效果。这些优化操作条件在流体力学相似条件下对更大填充床色谱柱的适用性将在第3.9节中另行讨论。

### 3.8 模型比较

对2? + 2析因模型和CCD模型进行了比较评估，以评估其预测能力和统计学稳健性，用于建模DBC?%（表S5(A)）。尽管本研究开发的数值系数和回归方程是针对所研究的特定色谱系统（STREAMLINE DEAE树脂和XK填充床色谱柱）的，但序贯实验设计方法——包括析因筛选、CCD、模型验证和实验确认——为在其他填充床色谱系统中优化DBC?%提供了一个系统性和可转移的框架，前提是进行适当的系统特异性标定和验证。

模型采用R2、调整R2、预测R2、PRESS、AIC、BIC和RMSE进行比较。如表S5(B)所示，2? + 2析因模型在所有统计指标上均优于CCD。析因模型的R2为98.97%，预测R2为94.82%，PRESS值为10.19，而CCD的R2为91.04%，预测R2仅为48.50%，PRESS值为104.39。析因模型还表现出更低的AIC、BIC和RMSE值，表明其在拟合优度、预测准确性和模型简洁性之间取得了更好的平衡。相比之下，CCD的R2与预测R2值之间的巨大差异表明存在严重的过拟合。

析因模型的优越表现可归因于在所选实验域内，研究的操作变量与DBC?%之间存在以线性关系为主的关系。中心点显示响应曲率有限，表明一阶模型足以描述实验数据。因此，CCD中引入的额外轴向点增加了模型复杂度，却未能改善预测性能。CCD模型显著失拟的观察结果（p < 0.001）进一步支持了这一解释。

析因模型的预测能力经实验确认。预测最优条件（pH 6.0、10%（w/v）进料浓度、10.0 mL/min流速和1.6 cm床层高度）的预测DBC?%为10.04 mg/mL，与实验测定值10.45 mg/mL高度一致（相对预测误差 = 2.9%）。由于工业色谱工艺很少运行至树脂完全饱和，DBC?%代表吸附剂的实际工作容量，因此可作为色谱工艺优化和流体力学放大的合适依据。

尽管DBC?%是动态操作条件下有效柱加载容量和工艺生产力的重要指标，但它并不能独立量化CPC的吸附选择性。由于粗制S. platensis提取物中含有蛋白质、色素、多糖、核酸、脂质和其他生物大分子，测得的DBC?%可能包含非目标成分共吸附的贡献。因此，本研究中的优化应主要被理解为对动态加载性能的评估，而非对纯化质量的完整优化。为补充DBC?%分析，采用回收率、纯化倍数和SDS–PAGE分析（补充信息，图S5）评估了纯化性能，确认了优化操作条件下CPC的有效富集。尽管如此，未来的色谱优化应采用多响应实验设计策略，同时考虑DBC?%、产品纯度、回收率、纯化倍数和工艺生产力，以实现吸附容量和分离选择性的平衡优化。

### 3.9 纯析因设计的局限性与中心点的价值

尽管2?析因模型取得了优异的统计性能（R2 = 98.97%；表S6），但其解释应考虑纯析因设计的固有局限性。传统的2?析因设计仅评估因子的极端水平，因此在所研究的实验域内假设响应是线性的。

没有中心点，实验设计无法检测曲率，无法提供纯实验误差的独立估计，也无法评估设计空间内部模型的有效性。在2? + 2设计中引入重复中心点有效地解决了这些局限性。中心点（第16和18次实验）提供了纯实验误差的独立估计，提高了统计分析的可靠性（表3a、表3b），同时使响应曲率的检测成为可能。后续与CCD（中心复合设计）的比较表明，纳入二次项并未提高预测性能，确认响应面已能被一阶交互模型充分描述。因此，2? + 2设计成功地识别了显著的主效应和交互效应——特别是进料浓度（效应 = 5.623）的强正效应和床层高度（效应 = ?3.244）的负效应——同时验证了优良模型拟合度代表了真实的响应面，而非线性近似的伪影。这些发现表明，纳入中心点显著增强了析因模型的预测稳健性，并为后续的过程优化和放大提供了可靠依据。

表3a. 包含中心点的2? + 2析因模型预测DBC?%（mg/mL-床层）的回归系数（编码单位）和模型统计量。给出了pH、进料浓度、流速和床层高度及其交互作用的主效应，包括系数、标准误（SE Coef）、T值和Student's t检验的p值。显著性水平标注为 ***p < 0.001，**p < 0.01，*p < 0.05，ns = 不显著。包含模型拟合统计量（S、R2、调整R2、预测R2、PRESS）以评估解释力和预测能力。

| 项 | 效应 | 系数 | SE Coef | T值 | p值 | 显著性 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 常数 | 2.249 | | 0.1155 | 19.47 | 0.000 | *** |
| pH | -0.709 | | 0.3550 | -2.90 | 0.018 | * |
| 浓度（%，w/v） | 5.623 | | 2.8110 | 23.00 | 0.000 | *** |
| 流速（mL/min） | -0.071 | | -0.0360 | -0.29 | 0.778 | ns |
| 床层高度（cm） | -3.244 | | -1.6220 | -13.27 | 0.000 | *** |
| pH × 浓度 | -0.803 | | -0.4010 | -3.28 | 0.009 | ** |
| pH × 流速 | -2.759 | | -1.3790 | -11.29 | 0.000 | *** |
| pH × 床层高度 | -0.089 | | -0.0450 | -0.37 | 0.723 | ns |
| pH × 浓度 × 流速 × 床层高度 | 2.511 | | 1.2560 | 3.48 | 0.008 | *** |

模型统计量：S = 0.4888；R2 = 98.91%；R2（adj）= 97.94%；R2（pred）= 94.82%；PRESS = 10.187

表3b. 包含中心点的2? + 2析因模型的方差分析（ANOVA），评估pH、进料浓度（%，w/v）、流速（mL/min）和床层高度（cm）对5%穿透动态结合容量（DBC?%，mg/mL）的影响。表格包括自由度（DF）、平方和、均方、F值和线性效应、交互作用及残差项的p值。相对于中心点重复纯误差的失拟度用于评估模型有效性。提供模型摘要统计量（S、R2、调整R2、预测R2、PRESS）。显著性：***p < 0.001，**p < 0.01，*p < 0.05，ns = 不显著。

| 来源 | DF | 调整SS | 调整MS | F值 | p值 | 显著性 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 模型 | 8 | 194.567 | 24.321 | 101.75 | 0.000 | *** |
| 线性 | 4 | 176.345 | 44.086 | 184.42 | 0.000 | *** |
| pH | 1 | 2.011 | 2.011 | 8.41 | 0.018 | * |
| 浓度（%，w/v） | 1 | 126.473 | 126.473 | 529.10 | 0.000 | *** |
| 流速（mL/min） | 1 | 0.020 | 0.020 | 0.08 | 0.778 | ns |
| 床层高度（cm） | 1 | 42.091 | 42.091 | 176.08 | 0.000 | *** |
| 二阶交互 | 3 | 15.322 | 5.107 | 21.36 | 0.000 | *** |
| pH × 浓度 | 1 | 2.579 | 2.579 | 10.79 | 0.009 | ** |
| pH × 流速 | 1 | 30.451 | 30.451 | 127.39 | 0.000 | *** |
| pH × 床层高度 | 1 | 0.032 | 0.032 | 0.13 | 0.723 | ns |
| 四阶交互 | 1 | 2.900 | 2.900 | 12.13 | 0.008 | ** |
| pH × 浓度 × 流速 × 床层高度 | 1 | 2.900 | 2.900 | 12.13 | 0.008 | ** |
| 误差 | 9 | 2.151 | | 0.239 | | |
| 失拟度 | 7 | 2.137 | 0.305 | 43.57 | 0.023 | * |
| 纯误差 | 2 | 0.014 | 0.007 | | | |
| 总计 | 17 | 196.718 | | | | |

模型统计量：S（标准误）= 0.4888；R2 = 98.97%；R2（adj）= 98.05%；R2（pred）= 98.07%；PRESS = 4.30

*显著性水平：***p < 0.001；**p < 0.01；*p < 0.05；ns = 不显著*

表4. CCD二次模型预测DBC?%（mg/mL-床层）的回归系数（编码单位）和模型统计量。使用Student's t检验评估了pH、进料浓度、流速和床层高度的线性、二次和交互效应。显著性：***p < 0.001，**p < 0.01，*p < 0.05，ns = 不显著。提供模型拟合统计量（S、R2、调整R2、预测R2、PRESS）。

| 项 | 效应 | 系数（Coef） | SE Coef | T值 | p值 | 显著性 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 常数 | –2.784 | | 0.4026 | 6.916 | 0.000 | *** |
| pH | ?0.005 | | ?0.0020 | ?0.005 | 0.996 | ns |
| 流速（mL/min） | 0.187 | | 0.0930 | 0.215 | 0.833 | ns |
| 进料浓度（%，w/v） | 8.862 | | 4.4310 | 10.190 | 0.000 | *** |
| 床层高度（cm） | ?4.727 | | ?2.3640 | ?5.435 | 0.000 | *** |
| pH2 | ?2.050 | | ?1.0250 | ?1.287 | 0.217 | ns |
| 流速2 | 0.720 | | 0.3600 | 0.452 | 0.658 | ns |
| 浓度2 | 0.584 | | 0.2920 | 0.366 | 0.719 | ns |
| 床层高度2 | 4.876 | | 2.4380 | 3.060 | 0.007 | ** |
| pH × 流速 | ?1.102 | | ?0.5511 | ?0.517 | 0.612 | ns |
| pH × 浓度 | ?0.466 | | ?0.2331 | ?0.219 | 0.830 | ns |
| pH × 床层高度 | ?0.064 | | ?0.0321 | ?0.030 | 0.976 | ns |
| 流速 × 浓度 | 0.610 | | 0.3051 | 0.286 | 0.778 | ns |
| 流速 × 床层高度 | ?1.630 | | ?0.8151 | ?0.765 | 0.455 | ns |
| 浓度 × 床层高度 | ?8.566 | | ?4.2831 | ?4.021 | 0.001 | *** |

模型统计量：标准误（S）= 1.065；PRESS = 104.392；R2（%）= 91.04；调整R2（%）= 83.21；预测R2（%）= 48.50

*显著性水平：***p < 0.001；**p < 0.01；*p < 0.05；ns = 不显著（p > 0.05）*

表5. CCD二次模型的方差分析（ANOVA），评估pH、进料浓度、流速和床层高度对DBC?%（mg/mL-床层）的影响。给出了线性、二次、交互作用和残差来源的自由度、平方和、均方、F值和p值。报告了相对于纯误差的失拟度。显著性：***p < 0.001，**p < 0.01，*p < 0.05，ns = 不显著。

| 来源 | DF | 序SS | 调整SS | 调整MS | F值 | p值 | 显著性 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 回归（模型） | 14 | 184.567 | 184.567 | 13.183 | 11.62 | 0.000 | *** |
| 线性 | 4 | 151.376 | 151.376 | 37.844 | 33.35 | 0.000 | *** |
| pH | 1 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.00 | 0.996 | ns |
| 流速 | 1 | 0.052 | 0.052 | 0.052 | 0.05 | 0.833 | ns |
| 浓度（C?） | 1 | 117.803 | 117.803 | 117.803 | 103.83 | 0.000 | *** |
| 床层高度（H） | 1 | 33.522 | 33.522 | 33.522 | 29.54 | 0.000 | *** |
| 二次项 | 4 | 13.730 | 13.730 | 3.433 | 3.03 | 0.049 | * |
| pH2 | 1 | 3.089 | 1.878 | 1.878 | 1.66 | 0.217 | ns |
| F2 | 1 | 0.017 | 0.231 | 0.231 | 0.20 | 0.658 | ns |
| C?2 | 1 | 0.002 | 0.152 | 0.152 | 0.13 | 0.719 | ns |
| H2 | 1 | 10.622 | 10.622 | 10.622 | 9.36 | 0.007 | ** |
| 交互作用 | 6 | 19.460 | 19.460 | 3.243 | 2.86 | 0.043 | * |
| pH × F | 1 | 0.304 | 0.304 | 0.304 | 0.27 | 0.612 | ns |
| pH × C? | 1 | 0.054 | 0.054 | 0.054 | 0.05 | 0.830 | ns |
| pH × H | 1 | 0.001 | 0.001 | 0.001 | 0.00 | 0.976 | ns |
| F × C? | 1 | 0.093 | 0.093 | 0.093 | 0.08 | 0.778 | ns |
| F × H | 1 | 0.664 | 0.664 | 0.664 | 0.59 | 0.455 | ns |
| C? × H | 1 | 18.344 | 18.344 | 18.344 | 16.17 | 0.001 | ** |
| 残差误差 | 16 | | 18.154 | 1.135 | | | |
| 失拟度 | 10 | | 18.114 | 1.811 | 274.66 | 0.000 | *** |
| 纯误差 | 6 | | 0.040 | 0.007 | | | |
| 总计 | 30 | | 202.721 | | 3.10 | | |

3.10. 放大验证与过程可放大性（2K + 2模型）

提出的放大策略使用经2? + 2析因模型验证的优化操作条件进行了实验评估。如第2.7节所述，通过保持恒定的床层高度（1.6 cm）、表观流速（50 cm/h）和停留时间来实现流体力学相似性，同时体积流量和样品上样体积根据柱截面积进行放大，符合已建立的填充床色谱放大原则[44,45]。虽然本研究开发的回归模型专属于所研究的色谱系统，但这些流体力学相似性原则为在适当实验验证后将优化操作条件转移至不同尺寸的色谱柱提供了一般性框架。

首先使用1.6 cm内径填充床色谱柱验证了优化操作条件（pH 6.0，10%（w/v）粗S. platensis提取物）。析因模型预测的DBC?%为10.04 mg/mL，而实验测定值为10.45 mg/mL，相对预测误差仅为2.9%，从而确认了模型的预测可靠性。相比之下，CCD模型预测的最优条件未进行评估，因为这些条件是通过外推超出已验证实验区域获得的。

随后在流体力学相似的操作条件下比较了1.6、2.6和5.0 cm内径色谱柱的穿透曲线。如图7所示，所有穿透曲线均汇聚于同一无因次主曲线（C/C?对V_L/V_C），所有柱尺寸的5%穿透点均出现在约V_L/V_C ? 1.46处。这种优良的叠合表明，在所研究的放大范围内，吸附前沿传播和传质区发展得到了有效保持。因此，DBC?%基本保持恒定，约为10.45 mg/mL，确认优化后的色谱性能在流体力学相似条件下得到了成功维持。

下载：下载高分辨率图片（160KB）
下载：下载全尺寸图片

图7. 不同直径（1.6、2.6和5.0 cm）填充床色谱柱在优化条件下（pH 6.0，C? = 9.05 mg/mL，床层高度H = 1.6 cm）的穿透曲线。体积流量经过缩放以保持恒定的50 cm/h表观流速，确保所有柱尺寸的停留时间相同。穿透数据以无因次形式表示为C/C?对V_L/V_C。叠合的轮廓表明在放大过程中流体力学和传质条件得到了成功保持，从而实现了恒定的动态结合容量DBC?% ? 10.45 mg/mL。误差线表示重复实验的实验变异性。

色谱性能的保持可归因于恒定停留时间（τ = H/u）的维持，这确保了可比的溶质-吸附剂接触时间以及跨所有柱尺寸的成比例一致的液膜外传质、颗粒内扩散和轴向弥散。然而，目前的验证仅限于所研究的实验室级和中试级色谱柱（1.6–5.0 cm内径）。在更大规模工业生产规模下，额外的流体力学现象——包括壁效应、径向流动分布不均、沟流、压降变化和增加的轴向弥散——可能影响穿透行为和整体过程性能。因此，在工业实施前，建议使用中试规模研究、RTD分析、CFD或其他机理流体力学模型进行进一步验证。

总体而言，这些结果表明，提出的流体力学放大策略为在保持研究操作域内一致DBC?%的同时，将实验室级色谱性能转移至更大填充床色谱柱提供了稳健实用的框架。

3.11. 模型适用性、局限性与未来展望

本研究开发的经验回归模型，包括其回归系数和预测的最优操作条件，专属于所研究的S. platensis原料、STREAMLINE DEAE树脂、填充床配置和操作条件。微藻种类、生物质组成、培养条件、提取程序、蛋白质谱、多糖和色素含量、提取物粘度以及其他理化性质的变化可能改变竞争吸附、传质行为和穿透特征。因此，数值模型及其优化操作条件不应直接应用于其他微藻原料或色谱系统，而应进行适当的实验重新校准和验证。

相比之下，序贯DoE方法具有广泛的适用性。相同的系统性框架——包括因子选择、实验设计、统计分析、模型开发、验证和优化——可应用于其他微藻种类或色谱系统，以建立系统特定的预测模型。然而，需要新的实验数据来重新估计回归系数并确定每种应用对应的最优操作条件。因此，虽然数值模型是系统特定的，但DoE方法为色谱过程优化提供了一般的、稳健的框架。

本研究主要关注使用定义的S. platensis提取物在吸附阶段对DBC?%的预测优化。因此，经验模型并未显式描述单个生物大分子之间的竞争吸附或潜在传质机制，包括液膜外传质、颗粒内扩散和轴向弥散。此外，洗脱方案在固定条件下维持，以提供评估吸附性能的一致基准，并未作为DoE模型中的优化变量。因此，仅对DBC?%的优化不一定代表最优的整体纯化过程，因为产品纯度、回收率、纯化因子、洗脱效率、缓冲液消耗、过程生产量、树脂利用率和经济与环境绩效未同时考虑。

未来研究应因此将现有框架扩展至吸附和洗脱的集成多响应优化。关键洗脱变量，包括盐浓度、pH、洗脱模式（阶梯或梯度）、洗脱体积和流速，应与DBC?%、产品回收率、纯度、纯化因子和过程生产量一起进行系统评估。此外，整合多目标DoE与机理传质模型、详细组成分析、停留时间分布（RTD）测量、压降评估、计算流体力学（CFD）、树脂再生研究和经济技术评估，将为CPC及其他微藻原料中其他高价值生物大分子的工业化纯化提供更全面的依据。

4. 结论

本研究建立了一种基于DoE的系统性方法，用于离子交换填充床色谱纯化CPC时DBC?%的预测优化和放大。2? + 2析因设计识别了pH、进料浓度、流速和床层高度对DBC?%的影响，其中进料浓度和床层高度分别施加了最强的正效应和负效应，而流速未显示出显著主效应（p = 0.778），但与pH存在显著交互作用（p < 0.001）。

2? + 2析因模型表现出优良的预测性能（R2 = 98.97%，预测R2 = 94.82%，PRESS = 10.19）。优化操作条件（pH 6.0，10%（w/v）进料浓度，10.0 mL/min流速，1.6 cm床层高度）预测DBC?%为10.04 mg/mL，实验验证值为10.45 mg/mL，相对预测误差仅为2.9%。相比之下，CCD表现出显著的过拟合（预测R2 = 48.50%，失拟度p < 0.001），表明在已研究的操作域内额外的二次项是不必要的。

从1.6到5.0 cm内径色谱柱的放大通过保持恒定的床层高度、表观流速和停留时间成功保持了DBC?%，表明在流体力学相似条件下实现了一致的色谱性能。虽然回归模型专属于所研究的粗S. platensis提取物、STREAMLINE DEAE树脂和操作条件，但基于DoE的优化工作流程和流体力学放大原则为其他填充床色谱系统提供了可转移的框架，这些框架在适当实验校准后可行。总体而言，本研究证明了带有中心点的简约析因设计为色谱过程优化和下游生物过程开发提供了一种稳健、准确且可放大的方法。

CRediT作者贡献声明

Shih-Long Hsu：调查、正式分析、数据整理。Nguyen The Duc Hanh：写作 – 初稿、正式分析、数据整理。Teerapat Hasakul：写作 – 初稿、正式分析、数据整理。Artitaya Srisakunchan：写作 – 初稿、正式分析、数据整理。Maythee Saisriyoot：写作 – 审阅与编辑、方法论、概念化。Hasrul Suhaimi：写作 – 审阅与编辑、方法论、概念化。Chen-Yaw Chiu：写作 – 审阅与编辑、资金获取、概念化。Bing-Lan Liu：监督、项目管理、方法论、概念化。Kuei-Hsiang Chen：写作 – 审阅与编辑、项目管理、资金获取、正式分析。Yu-Kaung Chang：写作 – 审阅与编辑、监督、项目管理、方法论、概念化。

Shih-Long Hsu | Nguyen The Duc Hanh | Teerapat Hasakul | Artitaya Srisakunchan | Maythee Saisriyoot | Hasrul Suhaimi | Chen-Yaw Chiu | Bing-Lan Liu | Kuei-Hsiang Chen | Yu-Kaung Chang

明志科技大学化工系，生技工程研究所，新北市，243303，台湾