唇裂偏侧性的遗传和表观遗传贡献因素：来自单卵镜像双胞胎和重复队列的证据

《Human Molecular Genetics》：Genetic and epigenetic contributors to cleft laterality: evidence from monozygotic mirror twins and replication cohorts

　　

非综合征性唇裂（nsCL）表现出非随机的偏侧性模式，左侧唇裂的发生频率是右侧的两倍。这种偏侧性偏差背后的分子机制仍知之甚少。研究人员对一个由镜像性nsCL单卵双胞胎、其受累母亲及未受累父亲和兄弟组成的家庭进行了全基因组测序和甲基化谱分析。研究人员通过公开可用的全基因组数据进行了三项独立重复；对38名单侧唇裂个体进行全基因组甲基化分析；并在385名无关的单侧非综合征性唇裂伴或不伴腭裂（nsCL/P）个体（DNA来自血液或唾液）中验证了前3个候选基因的甲基化结果。研究人员鉴定到双胞胎及其母亲共有的FGF20（p.Ile79Val）变异。研究人员观察到三个主要基因中与偏侧性和严重程度相关的甲基化差异。ARID5B在左侧唇裂中显示较高的甲基化（唾液，P?=?.001；血液，P?=?.032）。ZFP57显示出强烈的裂度效应，唇裂伴腭裂（CLP）的甲基化明显高于单纯唇裂（CL）（LCLP vs. RCL p_adj?=?0.0004；LCLP vs. LCL p_adj?=?0.019）。HOOK2在相反方向上显示出跨组织的裂度效应——在血液（P?**唇裂偏侧性的遗传与表观遗传机制：来自单卵镜像双胞胎及重复队列的证据**

唇腭裂是最常见的先天性畸形之一，约影响全球1/700的活产儿，其中约70%为非综合征性。单侧唇裂具有显著的非随机偏侧性分布，左侧与右侧之比约为2:1，提示其背后存在特定的生物学机制，而非随机的发育事件。然而，目前对唇裂偏侧性的分子基础仍知之甚少。既往对唇腭裂镜像双胞胎的全基因组测序未发现可解释偏侧性差异的遗传变异，提示表观遗传机制可能在修饰唇裂偏侧性方面发挥关键作用。同时，偏侧性（左/右）与裂度（是否累及腭部）是唇裂表型异质性的两个独立维度，但以往表观遗传研究很少分别分析。为此，研究人员利用单卵镜像双胞胎家庭这一独特自然模型，结合多队列重复验证，系统探讨遗传和表观遗传因素对唇裂偏侧性和严重程度的贡献。该论文发表在《Human Molecular Genetics》。

研究人员对包括单卵镜像双胞胎（一例左侧微小型唇裂，一例右侧微小型唇裂）、受累母亲及未受累父亲和弟弟的家庭进行了全基因组测序和DNA甲基化谱分析，并通过三项独立重复——公开全基因组数据、38例单侧唇裂个体的全基因组甲基化筛查、385例无关nsCL/P个体的靶向甲基化验证——确认候选位点。研究鉴定出FGF20错义变异（p.Ile79Val）为共享的潜在致病突变，并发现ARID5B、ZFP57和HOOK2的甲基化分别与偏侧性和裂度相关，表明DNA甲基化在唇裂表型塑造中发挥下游修饰作用。

关键技术方法包括：全基因组测序（30×覆盖度，DRAGEN比对，CADD/SIFT/PolyPhen2/ACMG/DOMINO注释）；Illumina EPIC BeadChip（>85万CpG位点）用于全基因组甲基化分析，EpiDISH进行细胞类型组成归一化；公开数据库分析（ENCODE调控元件、Cotney Lab人颅面表观基因组学数据集GSE97752、GSE197513及phs002008的bulk/scRNA-seq）评估FGF20表达；复制队列包括38例（血9右/13左，唾液7右/9左）和385例（血、唾液分开，按四种亚型均衡），并使用1611例多族裔三系（phs001168等）进行FGF20传递不平衡检验。

**全基因组测序鉴定共享的蛋白质破坏性变异**：对双胞胎间不一致的蛋白质破坏性变异分析未发现能解释偏侧性差异的致病性变异。在双胞胎与受累母亲共有的16个罕见蛋白质破坏性变异中，FGF20（p.Ile79Val）被预测为常染色体显性遗传，成为主要候选基因。该变异位于成纤维细胞生长因子家族结构域，且人颅面表观基因组学显示FGF20内增强子峰在Carnegie阶段13–17最高，对应于原发腭形成关键期；bulk和单细胞RNA测序显示FGF20在CS13–22的颅面组织中显著表达，支持其在唇腭发育中的作用。然而，该变异不能解释双胞胎之间的左右差异，因为两者均携带同样的变异。

**In silico分析揭示FGF20在胚胎发育期间颅面组织中的显著转录**：通过ENCODE和Cotney Lab数据确认FGF20内存在增强子样、启动子样及CTCF结合元件，且最高增强子峰出现在CS13–17。在4–8周人胚胎颅面组织（GSE197513, phs002008）中，FGF20从CS13起显著表达并持续至CS17，与腭发育时间窗吻合。

**DNA甲基化分析鉴定差异甲基化区域**：双胞胎血液DNA的全基因组甲基化比较发现408个CpG位点（Δβ绝对值>5%），其中100个在左裂双胞胎中高甲基化，308个在右裂双胞胎中高甲基化。这些DMP富集于“胚胎发育中的DNA甲基化”生物学过程。特别值得注意的是，ZFP57转录起始位点上游3.3–4.2 kb的基因间区域存在14个连续差异甲基化CpG位点（Δβ=7%–12%），均显示左裂高甲基化。ARID5B和HOOK2各有一个基因体区域的DMP（cg22368847和cg11738485）。在38例独立队列中，ZFP57的cg06032337呈边缘显著（唾液P=.06），ARID5B（血P=.002）和HOOK2（血和唾液P=.02）显著。

**额外重复证实偏侧性和裂度相关的甲基化模式**：在385例大样本分层分析中，三个基因呈现独特的组织特异性和维度特异性信号。ARID5B在血液（左70.7% vs 右66.5%，P=.032）和唾液（左62.1% vs 右50.5%，P=.001）中均显示左侧高甲基化，是唯一跨组织一致的偏侧性标记；唾液亚型分析中LCL中位甲基化（70.9%）显著高于RCL（44.5%）和RCLP（54.5%）。ZFP57在唾液中显示右侧高甲基化（右63.5% vs 左52.3%，P=.016），方向与ARID5B相反；在血液中无偏侧性效应，但显示出强烈的裂度效应，CLP亚型（LCLP中位56.8%）显著高于CL亚型（LCL 31.0%，RCL 25.4%）。HOOK2在两种组织中均无偏侧性效应，但显示与ZFP57相反的裂度效应：CLP亚型相对于CL亚型显著低甲基化（血液P<.0001，唾液P=.0008）；唾液还发现LCL与RCL的组内偏侧性差异（padj=0.046）。

讨论部分总结了这些发现的生物学意义。研究人员指出，ARID5B、ZFP57和HOOK2的甲基化信号沿偏侧性和裂度两个独立维度分布。ARID5B作为染色质重塑因子，其跨组织偏侧性信号可能反映了早期胚胎模式形成中建立的系统性表观遗传不对称。ZFP57作为基因组印记的主调控因子，其唾液偏侧性（右>左）和血液裂度（CLP>CL）效应揭示了印记相关调节的不同层面。HOOK2编码微管结合蛋白，参与腭突间充质细胞骨架重塑，其CLP低甲基化方向与ZFP57相反，提示不同通路在腭部受累中受差异调控。研究还讨论了血液与唾液DNA甲基化所代表的不同组织学信息，以及人群中血/唾液组的种族构成差异等局限。

研究结论可概括为：这项研究提供了证据表明DNA甲基化模式在唇裂的偏侧性和严重程度中都发挥作用。ARID5B提供了跨组织一致的偏侧性信号，而ZFP57和HOOK2独立于侧别追踪腭部受累。总之，这些发现表明表观遗传变异在遗传易感性的下游起作用，以塑造唇裂表型。

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