微米级的乳铁蛋白蛋白体可增强乳腺癌患者的免疫反应及化放疗效果

《International Journal of Biological Macromolecules》：Micron-scale lactoferrin proteinosomes potentiate immune activation and chemo-immunotherapy in breast cancer

　　

摘要

抗原呈递细胞（APCs）对蛋白质基佐剂的免疫刺激性能至关重要，但可溶性蛋白质通常存在细胞内化能力差和免疫激活作用短暂的问题。在这里，我们报告了一种分层的微米级组装策略，通过界面自组装来构建乳铁蛋白脂质体（LPs）。这些球形的LPs平均直径约为2微米，具有良好的结构稳定性，同时保持了乳铁蛋白的天然二级结构。与单体乳铁蛋白相比，LPs显著增强了巨噬细胞和树突状细胞（DCs）的摄取能力。LPs促进了促炎性的巨噬细胞激活，表现为CD80、CD86和MHC-II的表达上调，以及IL-1β、TNF-α、IL-6和一氧化氮的分泌增加。转录组分析进一步揭示了LPs处理的巨噬细胞中与多种先天性免疫信号通路相关的炎症基因表达特征。此外，LPs在体外促进了DC的表型成熟，并在体内增强了淋巴结中的DC激活，同时具有良好的生物安全性，并提高了系统性的免疫刺激细胞因子的水平。在4T1乳腺肿瘤模型中，LPs与多柔比星联合使用通过重塑肿瘤免疫微环境显著改善了治疗效果，表现为巨噬细胞、DCs和T细胞的浸润增加。总体而言，这项工作展示了分层微米级组装在增强蛋白质作为免疫佐剂活性方面的潜力。

引言

癌症免疫疗法通过利用宿主免疫系统识别和消除肿瘤，重塑了恶性疾病的治疗格局。尽管取得了显著进展，但由于抗原呈现不足、先天性免疫激活弱以及肿瘤微环境（TME）的免疫抑制作用，免疫疗法在许多实体肿瘤中的疗效仍然有限[1]，[2]。在这种背景下，免疫佐剂作为一种重要类别的剂型被提出，通过促进抗原呈递细胞（APCs）的激活、增强炎症信号以及促进适应性免疫反应的启动来增强抗肿瘤免疫力。然而，许多基于蛋白质的免疫佐剂的治疗效果仍然不令人满意，主要是由于它们的细胞内化能力差、在免疫部位的滞留时间有限以及给药后生物活性短暂[3]，[4]，[5]。因此，开发有效的策略以改善APCs的参与度并维持蛋白质佐剂的免疫刺激功能对于癌症免疫疗法具有重要意义。

在APCs中，巨噬细胞和树突状细胞（DCs）在协调抗肿瘤免疫反应中扮演着中心和互补的角色。巨噬细胞是高度可塑的先天免疫细胞，可以根据环境信号采取抑制性或促炎性表型，从而对肿瘤进展和治疗反应性产生关键影响[6]，[7]，[8]。同时，DCs是抗原处理和T细胞启动最有效的专业APCs，它们的成熟和向淋巴结的迁移对于有效适应性免疫的启动至关重要[9]，[10]，[11]。因此，同时增强巨噬细胞激活和DC成熟的生物材料策略正受到越来越多的关注，以加强免疫干预[12]，[13]，[14]，[15]。然而，可溶性蛋白质通常依赖被动扩散和非特异性摄取，这往往导致与APCs的相互作用不足和免疫刺激效果不佳[16]，[17]。因此，将蛋白质结构工程化为颗粒系统提供了一种提高其免疫可及性和生物功能的有效途径。

乳铁蛋白是一种天然的铁结合糖蛋白，具有广泛的免疫调节、抗炎和抗菌特性，作为生物活性成分在免疫疗法和药物递送中引起了越来越多的关注[18]，[19]，[20]，[21]。先前的研究表明，乳铁蛋白可以调节巨噬细胞的极化，促进细胞因子的分泌，并调节与DC相关的免疫功能，突显了其作为蛋白质基免疫佐剂的潜力[22]，[23]，[24]。然而，像许多可溶性蛋白质一样，单体乳铁蛋白仍受限于有限的摄取效率和APCs的激活不足，这可能影响其体内的免疫刺激效果[25]，[26]。除了生化组成外，材料的物理形态，包括其大小、形态和结构层次，对细胞识别和内化行为有深远的影响[27]，[28]，[29]，[30]。特别是，微米级的结构更易于被专业免疫细胞吞噬处理，表明合理的尺寸工程可能提供一种有用的方法来改善APCs的摄取并增强下游的免疫激活[31]。

受这一概念的启发，我们试图构建一种结构稳定的微米级乳铁蛋白组装体，以增强免疫细胞的摄取同时保持蛋白质的固有生物活性。在这项研究中，通过界面自组装和共价交联制备了乳铁蛋白脂质体（LPs），这些脂质体为球形微米级结构，具有良好的稳定性和保留的二级结构。我们假设将可溶性乳铁蛋白转化为分层的微米级结构将改善其与APCs的相互作用，从而增强其免疫佐剂活性（图1）。正如本研究所示，LPs显著增强了巨噬细胞和DCs的摄取，促进了促炎性巨噬细胞的激活，并促进了淋巴结中的DC成熟和激活。此外，在测试条件下，LPs表现出良好的生物安全性，并通过重塑肿瘤免疫微环境提高了4T1乳腺肿瘤模型中多柔比星的治疗效果。总体而言，这项研究展示了微米级蛋白质组装作为一种实用且多功能的策略，用于增强基于蛋白质的佐剂的免疫学性能，并推进结合化疗-免疫疗法的发展。

章节片段

化学品和试剂

乳铁蛋白（LF）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。戊二醛、十二烷基苯磺酸钠（SDBS）、2-乙基己醇、盐酸多柔比星（DOX）和罗丹明B（RhB）购自Energy Chemical（中国安徽）。胎牛血清（FBS）购自Gibco-Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）和Roswell Park Memorial Institute 1640培养基（RPMI-1640）购自KeyGEN BioTECH有限公司（南京）。

LPs的制备和物理化学表征

LPs是通过LF和SDBS在油-水界面的界面自组装制备的。ζ电位分析表明，LF在PBS中带有正电荷，而SDBS带有强负电荷。复合物形成后，LF/SDBS组装体的ζ电位变为约+3 mV，表明有效的静电相互作用和前体的成功形成（图1a）。加入2-乙基己醇和戊二醛后，形成了稳定的LPs。

结论

总的来说，我们报告了一种分层的微米级组装策略，通过界面自组装制备了平均直径约为2微米的乳铁蛋白脂质体（LPs）。这些LPs具有良好的结构稳定性，并保持了乳铁蛋白的天然二级结构。与单体乳铁蛋白相比，LPs显著增强了抗原呈递细胞的摄取能力，促进了促炎性巨噬细胞的激活，并增强了树突状细胞的成熟和激活。

CRediT作者贡献声明

Miaomiao Xu：验证、方法学、研究、资金获取、正式分析、概念化、编写——原始草稿。Shenghao Hu：验证、方法学、研究、正式分析、编写——原始草稿。Shuqing Gan：方法学、研究。Mingyu Yan：方法学、研究。Ruimin Wang：方法学、研究。Qiang Yan：验证、正式分析。Lixing Weng：监督、项目管理、资金获取、概念化、编写——

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文报道的工作。

致谢

这项工作得到了中国国家自然科学基金（62227803、62288102、22307056）、江苏基础研究计划（BK20253006）以及江苏一带一路创新合作项目（BZ2022011）的财政支持。

Miaomiao Xu|Shenghao Hu|Shuqing Gan|Mingyu Yan|Ruimin Wang|Qiang Yan|Lixing Weng