来自Weissella cibaria SK01的一种富含甘露糖的外多糖：纯化、特性研究、抗菌膜形成作用、抗癌效果及其理化性质

《International Journal of Biological Macromolecules》：A mannose-rich exopolysaccharide from Weissella cibaria SK01: Purification, characterization, antibiofilm, anticancer, and physicochemical properties

　　

摘要

从绞碎的牛肉中分离出的乳酸菌（LAB）菌株中，通过16S rRNA基因测序鉴定出一种能够有效产生胞外多糖（EPS）的细菌，其为Weissella cibaria SK01。这种菌株产生的EPS称为EPS-SK01，其产量相对较高（2.79克/升），并通过连续的色谱程序纯化至几乎纯度一致。通过单糖组成分析、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、凝胶渗透色谱（GPC）和一维核磁共振（NMR）等结构表征手段发现，EPS-SK01主要由α-连接的马诺糖残基组成，这需要进一步的高级结构分析来验证。扫描电子显微镜（SEM）和原子力显微镜（AFM）分析显示，EPS-SK01具有分层的多孔结构，表面特征从纳米尺度到微米尺度都有分布。热分析（DSC、DTG和TGA）表明其具有明确的热转变行为和显著的热稳定性，主要分解温度约为273摄氏度。EPS-SK01表现出良好的理化性质，如高溶解度、剪切变稀的流变特性以及高效的乳化 和发泡能力。此外，EPS-SK01具有浓度依赖性的抗氧化活性（DPPH IC₅₀ = 22.95毫克/毫升）和对抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的抗菌活性（MIC为5毫克/毫升）。它还能抑制MRSA生物膜的形成，抑制程度达到55.3±1.7%，这与生物膜相关基因（icaA、icaD和srtA）以及群体感应调控基因的表达显著降低有关。在MCF-7乳腺癌细胞中，EPS-SK01表现出剂量依赖性的抗增殖活性，IC₅₀值为1313微克/毫升，同时对正常L929成纤维细胞的毒性可忽略不计。综上所述，EPS-SK01被认为是一种具有独特结构和生物活性的微生物胞外多糖，在发酵食品加工行业中具有广泛应用潜力。

引言

微生物及其代谢产物在现代微生物工业中具有重要价值，因为它们具有结构多样性、可持续性和功能适应性[1]。基于碳水化合物的聚合物是一类天然存在的大分子，在过去几十年中由于其在工业上的广泛应用而受到越来越多关注[2]。微生物胞外多糖（EPS）独特的生物性质、低生产成本以及广泛的应用范围，使其成为制药、营养保健品、化妆品、食品和农业领域的主要生物聚合物[3]。根据其在细胞内的位置，多糖可分为三类：胞内多糖、细胞壁多糖和胞外多糖（exopolysaccharides）[4]。在生长过程中，许多细菌会分泌胞外聚合物（EPS），这类高分子由重复的单糖单元组成[5]。由于具有天然的无毒性、生物相容性和可生物降解性，这些聚合物在工业和生物医学应用中非常具有吸引力[6]。根据单体组成，EPS可分为杂聚糖（通常由两种到八种不同的单糖单元组成）和同聚糖（由一种单糖组成）[7]。胞外多糖的功能性能取决于其单糖组成、分子量、官能团和糖苷键类型，这些因素都会影响其理化、流变和生物性质[8]。胞外多糖具有多种生物功能，包括免疫调节、抗癌、抗溃疡、抗氧化和降胆固醇作用[9]。由于具有增稠、保水、乳化和稳定性等特性，它们还可用作功能性成分和生物基材料[10]。环境和培养条件以及菌株的遗传特性显著影响乳酸菌（LAB）产生的EPS的合成、组成和性质，从而形成结构独特、功能多样的多糖[11]。

乳酸菌（LAB）是一种革兰氏阳性菌，通常被认为是安全的（GRAS）菌，广泛用于食品发酵和生物技术过程。Lactobacillus、Lactococcus、Streptococcus、Enterococcus、Leuconostoc、Pediococcus、Oenococcus和Weissella属菌是已知的胞外多糖（EPS）生产者[12]。由于这些优良特性，乳酸菌产生的微生物EPS作为可持续的生物聚合物，在食品和生物医学应用中受到了越来越多的关注。Weissella属菌因其能够合成结构多样、具有多种生物和功能特性的多糖而被认为是有前景的EPS生产者[13]。

各种微生物胞外多糖（EPS）具有广泛的生物活性，其中抑制细菌生物膜的形成尤为值得关注，因为生物膜的形成会显著增加抗菌剂的抗性[14]。然而，它们调节致病性生物膜形成细菌的生物膜相关基因和群体感应调控途径的分子机制仍需进一步阐明。尽管一些微生物EPS具有抗生物膜活性，但调节耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）生物膜相关基因表达和群体感应调控的分子机制仍需进一步研究。此外，产生EPS的菌株的生态起源也会影响多糖的组成和功能[15]。来自肉类的乳酸菌栖息在营养丰富的生态环境中，是未知的EPS产生微生物的来源[16]。与发酵乳制品和植物产品相比，尽管绞碎的牛肉具有丰富的微生物多样性，但它作为产生EPS的Weissella菌株的来源却鲜有关注。

尽管关于Weissella属菌产生的EPS的研究越来越多，但我们目前的知识仍存在许多空白。虽然大多数关于Weissella来源的EPS的研究集中在葡聚糖或右旋糖酐型多糖上，但富含马诺糖的EPS相对较少，尤其是在分子结构、结构和功能特性方面需要进一步研究[17]、[18]、[19]、[20]。因此，本研究旨在鉴定一种能够从绞碎肉中高效产生EPS的Weissella菌株，并使用综合的结构、理化和生物学方法对其纯化的EPS进行全面表征。这种综合方法将有助于深入了解Weissella富含马诺糖的EPS的结构-功能关系，突出其在食品和生物医学领域的应用潜力。

章节摘录

乳酸菌的采样、分离和分子鉴定

绞碎的牛肉样品在无菌条件下包装，并符合卫生法规要求，标明了具体的生产和过期日期，来源于伊朗德黑兰的一家可靠商家。样品在控制条件下（4±1℃）用保温箱运输至实验室，耗时1小时。随后，将25克样品无菌转移到含有200毫升高压灭菌后的De Man–Rogosa–Sharpe (MRS) 盆栽培养基的锥形瓶中。

细菌菌株的分离和鉴定

在初步分离出三种具有独特菌落形态的细菌菌株后，通过连续传代和筛选，选择出一株具有黏液状结构、圆形、大小适中、边缘光滑且呈白色（典型的乳酸菌特征）的菌株（图1a）。随后将该菌株接种在MRS琼脂上纯化。革兰氏染色后的显微镜检查显示为革兰氏阳性杆菌（图1b）。

讨论

本研究的主要目的是全面研究新鉴定的Weissella cibaria菌株产生的EPS-SK01的结构和功能特性，并确定其独特的理化和生物学特征。通过去除蛋白质、核酸、色素和其他低分子杂质，纯化过程提高了回收EPS的质量[67]。回收效率是在优化各种因素之间的平衡。

结论

这项广泛的研究加深了我们对从绞碎肉中分离出的新鉴定Weissella cibaria菌株产生的结构独特的富含马诺糖的胞外多糖的理解。EPS-SK01是一种多功能且具有重要性质的生物分子，其特征包括丰富的马诺糖组成、高分子量、低多分散性和主要以α-键连接的主链。

CRediT作者贡献声明

Sahar Javadi：方法学研究、数据分析。Sedighe Mehrabian：验证、数据分析。Fatemeh Ashrafi：验证、方法学研究、数据分析。Hossein Shahbani Zahiri：写作-审稿编辑、验证、方法学研究、数据分析。Kambiz Akbari Noghabi：写作-审稿编辑、可视化处理、项目监督、资金筹集、数据分析、概念构思。

资助

本研究得到了伊朗德黑兰国家遗传工程与生物技术研究所（NIGEB）的财政支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系

可能影响本文所述工作。

Sahar Javadi|Sedighe Mehrabian|Fatemeh Ashrafi|Hossein Shahbani Zahiri|Kambiz Akbari Noghabi