提取技术对天麻多糖结构特征及免疫调节活性的影响

《International Journal of Biological Macromolecules》：Impact of extraction techniques on the structural features and immunomodulatory activity of polysaccharides from Cremastra appendiculata

　　

• •
  七种提取方法获得了结构各异的CAP组分。
• •
  甲基化分析显示各组分共享葡甘露聚糖键合，但次要键合存在差异。
• •
  ACE-P组分表现出最强的巨噬细胞刺激活性。
• •
  药理学抑制实验表明TLR4及介质依赖的NF-κB信号通路参与该过程。

引言

植物来源的多糖作为天然大分子，因其结构多样性、生物相容性和广泛的生物活性而日益受到关注。附生石仙桃（Cremastra appendiculata (D. Don) Makino，"山慈姑"）是一种多年生兰科植物，长期以来在中医中有所应用[1]，目前已被广泛栽培。由于需求上升和野生资源的枯竭，其假鳞茎价格已达约1500元人民币/公斤，这推动了大规模栽培，尤其在中国西南地区[2]。随着栽培范围的扩大，提高附生石仙桃生物量的利用率，包括其多糖部分，变得越来越重要。

植物化学研究表明，附生石仙桃含有多种成分，包括菲类、黄酮类、二苯甲烷和多糖[1]。目前的提取工作主要集中于药用和营养用途的小分子化合物[3]，而产生的残渣（可能保留有细胞壁多糖）通常被丢弃。先前的结构研究将一种附生石仙桃多糖表征为由(1→4)-连接的β-甘露糖和β-葡萄糖残基组成的甘露葡萄糖[4]，而CAP制剂已显示出抗肿瘤、抗炎、保肝和免疫调节活性[1]。

除这些活性外，植物多糖还表现出乳化、增稠、凝胶化和保水性等功能特性。在其生物作用中，免疫调节——尤其是巨噬细胞的激活——与其健康相关功效密切相关[5]、[6]、[7]，这使得它们在功能食品和营养保健品方面备受关注。因此，阐明CAP的结构特征与其免疫调节活性之间的关系对于其进一步评价具有重要意义。

多糖组分的结构，包括分子量、单糖组成、糖苷键合和链构象，受提取方法的强烈影响[8]。不同技术通过不同的机制发挥作用：热水提取（HWE）中的热效应、超声辅助提取（UAE）中的声空化、酶辅助提取（EAE）中的酶解、酸辅助提取（ACE）中的酸水解，以及微波辅助提取（MAE）中的介电加热。这些机制可以选择性地溶解不同的多糖群，或改变链长、取代基丰度、分支度和聚集状态，从而产生具有不同分子性质和活性的组分。热水提取被广泛使用，但可能效率较低，并可能降解不稳定的结构。比较研究阐明了这些效应：红花残渣的碱提取产生了具有更好乳化和发泡性能的多糖[9]；对榕树的酶辅助提取改善了乳化稳定性，而超声辅助提取产生了具有更高抗氧化能力的低分子量片段[10]；加压水提取（PWE）和微波辅助提取（MAE）获得的枇杷叶多糖在分子量和活性方面与热水提取（HWE）的结果不同[11]；深共晶溶剂提取（DESE）提高了日本委陵菜多糖的收率、纯度和抗氧化能力[12]。这些结果表明，提取方法对植物多糖的结构和性质具有重要但各异的影响。

然而，对于CAP，关于提取方法如何影响结构和生物活性的系统研究仍然匮乏。大多数工作要么优化了单一的提取技术[13]，要么进行了初步的物理化学和生物学分析[1]。缺乏整合提取依赖的结构差异、比较糖苷键合信息、巨噬细胞活性和受体相关证据的系统比较，这限制了CAP提取工艺的合理选择。

为弥补这一空白，本研究比较了七种提取技术——HWE、ACE、UAE、MAE、EAE、PWE和DESE——对CAP的影响。具体目标为：(a) 比较提取收率和基本化学组成；(b) 表征并比较结构性质，包括分子量分布、单糖组成、官能团、糖苷键合、微观形态和热稳定性；(c) 通过测量RAW264.7细胞中巨噬细胞的活性和一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白介素-6（IL-6）的分泌来评估并关联免疫调节活性，并探索活性与结构参数之间的关联。通过整合这些分析，本研究旨在阐明提取依赖的结构和活性差异，并为进一步机理和体内评价中的CAP组分选择提供参考。

章节摘要

材料与试剂

新鲜的附生石仙桃（Cremastra appendiculata (D. Don) Makino）采自中国贵州毕节。纤维素酶（3 U/mg）、果胶酶（40 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）、牛血清白蛋白（BSA）、D-葡萄糖和考马斯亮蓝G-250购自索莱宝科技有限公司（中国北京）。单糖标准品（葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖、核糖、 galacturonic acid、阿拉伯糖、glucuronic acid）购自博瑞糖生物科技有限公司（扬州，

提取收率与化学组成

采用七种提取方法获得CAP：热水（HWE）、酸辅助（ACE）、酶辅助（EAE）、超声辅助（UAE）、加压水（PWE）、微波辅助（MAE）和深共晶溶剂提取（DESE）。提取过程总结于图1中。收率和化学组成列于表1中。提取收率在20.72%至49.89%之间。ACE-P收率最高（49.89%），这可能反映了多糖的增溶化

结论

本研究显示，提取方法强烈影响附生石仙桃多糖的结构及其体外免疫调节活性。所有七个组分均显示出与富含葡甘露聚糖框架一致的结构特征，但在分子量、单糖组成、O-乙酰化和链构象方面存在差异。对DESE-P、ACEP、HWEP和UAE-P的比较甲基化分析确认了主要的→4)-Manp-(1→和→4)-Glcp-(1→键合，并揭示了

CRediT作者贡献声明

姚元：撰写——初稿、调查、数据整理。庞坤：调查、数据整理。孙燕：调查。梁青：资金获取、正式分析。刘英波：验证、资源。吴定涛：撰写——审阅与编辑、调查。张健勇：撰写——审阅与编辑、监督、构思。邓勇：撰写——审阅与编辑、监督、方法学、资金获取、构思。

未引用的参考文献

[44]

利益冲突声明

作者声明，他们不存在已知的、可能影响本文所报告工作的竞争财务利益或个人关系。

姚元|庞坤|孙燕|梁青|刘英波|吴定涛|张健勇|邓勇