《International Journal of Infectious Diseases》：Nanopore sequencing enhances the detection of low-frequency variants and mutational linkage in HIV-1 drug resistance
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摘要
目的： 低频HIV-1耐药突变（DRMs）及病毒基因组内的突变连锁可能导致治疗失败和多药耐药，但使用常规测序难以解析。研究人员评估了纳米孔长读长测序在HIV-1 DRM检测和单倍型分析中的性能。
方法： 在这项回顾性研究中，分析了2024年8月至2025
摘要
目的： 低频HIV-1耐药突变（DRMs）及病毒基因组内的突变连锁可能导致治疗失败和多药耐药，但使用常规测序难以解析。研究人员评估了纳米孔长读长测序在HIV-1 DRM检测和单倍型分析中的性能。
方法： 在这项回顾性研究中，分析了2024年8月至2025年7月期间在北京地坛医院接受耐药检测的230份HIV感染者血浆样本，使用基于纳米孔的G-seq500平台进行分析。将DRM谱和亚型分类与Sanger测序进行比较，不一致的突变通过下一代测序（NGS，DNBSEQ-T7平台）进行验证。长读长数据进一步用于单倍型重建。
结果： G-seq500与Sanger测序在DRM检测中的总体一致率为93.0%。G-seq500鉴定出的额外耐药相关突变经NGS确认，且主要为低频变异。亚型分型一致率为92.2%（212/230）。单倍型重建揭示了显著的宿主内病毒多样性，近半数样本含有多个病毒单倍型。多个DRM经常在同一单倍型内共现，表明存在连锁的多药耐药病毒群体。
结论： G-seq500测序在HIV-1 DRM检测和亚型分型方面表现出与Sanger测序相当的性能。长读长测序进一步实现了低频耐药相关变异和宿主内病毒单倍型结构的表征，为超越传统共有序列测序的HIV-1耐药复杂性提供了额外见解。
论文解读：纳米孔测序技术提升HIV-1耐药检测能力——低频变异与突变连锁的突破性分析
一、研究背景与问题
HIV-1感染仍是全球重大公共卫生挑战。截至2024年12月，全球约有4100万HIV-1感染者，其中3160万人正在接受抗逆转录病毒治疗（ART）。尽管ART的广泛实施显著降低了HIV相关的发病率和死亡率，但耐药突变（DRMs）的出现和传播持续威胁着治疗效果。HIV-1具有极高的遗传变异性，其高复制率、易错的逆转录酶活性和频繁的重组事件导致病毒在感染者体内持续进化，形成复杂的病毒准种群体，不同病毒变异体可能携带不同的DRM并表现出不同的药物敏感性谱。
HIV-1耐药性不仅取决于群体水平上单个突变的存在或频率，还受到单个病毒基因组内多个DRM的积累和基因组组织的影响。当影响不同药物类别的耐药相关突变共存于同一病毒基因组时，可能产生对联合ART方案敏感性降低的多药耐药病毒群体。反之，分布于不同病毒亚群中的相同突变可能代表具有不同耐药解读意义的不同进化谱系。因此，仅凭群体水平的突变频率无法完全表征耐药格局，解析单个病毒基因组上DRM的物理连锁和组合模式对于理解耐药进化、治疗风险和宿主内病毒群体动态至关重要。
然而，从异质性HIV-1群体中准确重建病毒单倍型在技术上仍具挑战性。宿主内病毒群体通常由大量密切相关变异体组成，测序错误可能被误判为真实的低频突变。可靠的单倍型重建需要足够的读长来捕获连锁的基因组信息，以及稳健的纠错策略来区分真实变异与技术伪影。
Sanger测序仍是临床和监测环境中HIV-1耐药检测的标准方法，但其有限的灵敏度无法可靠检测频率低于约15%–20%的变异。下一代测序（NGS）显著提高了低频变异检测的灵敏度，但短读长测序方法通常无法确定样本中鉴定的多个突变是发生在同一病毒基因组上还是代表不同的病毒亚群。因此，现有方法无法同时提供灵敏的少数变异检测和准确的病毒单倍型结构重建。
长读长测序技术，包括Oxford Nanopore Technologies（ONT）和Pacific Biosciences单分子实时（SMRT）测序，通过保留长距离基因组信息并实现单个病毒基因组内连锁突变的直接表征，克服了短读长方法的局限性。G-seq500平台是一种新兴的基于纳米孔的测序系统，其通过纳米孔合成测序（NSS）策略区别于传统ONT测序技术，结合环状模板扩增和多亚读长共有序列生成实现高精度序列确定。尽管G-seq500已在细菌菌株分型、线粒体单倍型分型和基因组组装等应用中展示了高保真性能，但其在HIV-1耐药分析中的应用尚未被系统评估，特别是在少数DRM检测和连锁耐药相关单倍型重建方面。
二、研究设计与方法
该研究为单中心回顾性研究，纳入2024年8月至2025年7月期间在北京地坛医院确诊的230例HIV感染者血浆样本，其中145例为ART初治、85例为ART经治。研究采用G-seq500纳米孔长读长测序平台对HIV-1 pol基因的蛋白酶-逆转录酶（PR+RT）和整合酶（IN）区域进行测序，并与Sanger测序结果进行比较，不一致突变通过DNBSEQ-T7平台的短读长NGS进行验证。关键的技术方法包括：基于纳米孔合成测序策略的G-seq500平台进行长读长测序；CD-HIT聚类和ClustalW多序列比对生成共有序列；Minimap2重比对计算核苷酸频率，以≥4%频率阈值报告候选DRM；基于SNP模式聚类的单倍型重建流程，以≥5%等位基因频率定义标签SNP，每个单倍型需至少5条读长支持；Sanger测序作为参考方法；NGS以≥1%频率作为正交验证筛选阈值。
三、研究结果
参与者特征： 230例PLWH中，基于Sanger测序，120例（52.17%）检出DRM，其中ART初治组77例（53.10%）、ART经治组43例（50.59%）。NNRTI相关DRM最为常见（84例），其次为NRTI相关（33例）、PI相关（18例）和INSTI相关（17例）。主要亚型为CRF01_AE（33.04%）和CRF07_BC（30.87%）。
G-seq500与Sanger测序DRM检测的一致性： 样本水平上，120例双阳性、108例双阴性、2例仅G-seq500阳性，阳性一致率（PPA）为100%，阴性一致率（NPA）为98.2%。突变水平上，14例样本存在DRM谱差异，加上2例混合氨基酸变异解读差异，共16/230例谱差异，总体谱一致率为93.0%。按病毒载量分层分析显示PPA在各组均保持100%，不同病毒载量组间不一致率差异无统计学意义（Fisher精确检验，P=0.37）。按亚型分层分析同样显示PPA均为100%，不同亚型间不一致率差异无统计学意义（P=0.40）。
NGS验证： 对16例突变水平不一致样本进行短读长NGS验证，G-seq500检出的所有额外DRM均获NGS确认，且大多数额外DRM的NGS频率低于20%，证实G-seq500能够检出Sanger测序无法发现的低频耐药相关变异。
亚型分型比较： 212/230例（92.2%）亚型分型一致，18例不一致。系统发育分析支持9例Sanger分型、2例G-seq500分型，4例根据系统发育聚类重新分类，3例因复杂重组结构无法定论。9例不一致涉及含CRF01_AE和CRF07_BC基因组组分的重组型，系统发育聚类与Sanger重组亚型分型一致，提示差异可能源于重组毒株亚型分配算法的差异而非测序不一致。
单倍型重建： PR+RT区域成功重建136/230例（59.1%），其中31例单倍型、105例多倍型；IN区域成功重建160/230例（69.6%）。单倍型重建揭示了显著的宿主内病毒多样性，近半数样本含多个病毒单倍型。多个DRM经常在同一单倍型内共现，表明存在连锁的多药耐药病毒群体。
四、讨论与结论
G-seq500测序在HIV-1 DRM检测和亚型分型方面表现出与Sanger测序相当的性能，同时能检出Sanger测序无法发现的低频耐药相关变异。长读长测序进一步实现了宿主内病毒单倍型结构的表征，为理解HIV-1耐药的复杂性提供了超越常规共有序列测序的额外见解。该研究系统评估了G-seq500平台在HIV-1耐药检测中的应用价值，证明纳米孔长读长测序能够在保持高准确性的同时提供低频变异检测和单倍型解析能力，为临床耐药监测和病毒群体动态研究提供了新的技术手段。该研究发表在《International Journal of Infectious Diseases》。
