人尿与农业用甲素和糖蜜的发酵：脲酶催化水解抑制与微生物群落增强

《International Biodeterioration & Biodegradation》：Fermentation of human urine with agricultural Jiaosu and molasses: urease-catalyzed hydrolysis inhibition and microbial community enhancement

　　

• 提出并验证了一种新型环保方法，利用农业酵素（AJ）和糖蜜发酵源分离尿液，以控制异味并减少病原微生物。
• 首次研究了发酵对尿液溶液中真菌群落的影响。
• 为实际应用推荐了一种高效经济的发酵方案。

1. 引言

生活污水通常由粪便污泥以及来自厨房、洗衣和沐浴的废水组成（Fan等，2021）。生活污水富含氮、磷和有机物，这些物质会导致水体富营养化和黑臭水体（Fan等，2021）。然而，这些相同的营养物质也可以作为农田的宝贵肥料（H?fner等，2023；Harder等，2019；Musazura和Odindo，2022）。传统的污水处理厂（WWTPs）专注于去除氮、磷和降解有机物以满足排放标准（Han等，2021）。相比之下，资源导向的方法将生活污水转化为可重复使用的水、营养物质和能源——同时实现减污和碳减排效益（Harder等，2019；Martin等，2022；Wald，2022）。这种方法与联合国2030可持续发展议程中提出的可持续发展目标6（SDG 6）相一致：清洁水和卫生设施（UN，2015）。

人类尿液中较高的营养浓度使其成为可持续卫生系统中源分离和资源回收的理想目标（Harder等，2019；Martin等，2022；Wald，2022）。然而，尿液收集和农业应用相关的病原体传播风险和高氨浓度需要谨慎缓解（Liu等，2017；Xu等，2022）。尿液收集者和使用尿液衍生肥料的农民都可能会感染尿液中存在的病原体（大肠杆菌、志贺氏菌属、沙门氏菌等），从而带来健康风险（Xu等，2022）。尿液中尿素的快速水解导致氨浓度升高，这不仅会产生难闻的排放物和职业健康危害，还会导致大量氮损失，降低其农业价值（Hellstr?m等，1999；Krishnamoorthy等，2020；Musazura和Odindo，2022）。为了降低尿液收集和农业应用中病原微生物和高氨浓度的风险，文献中研究了多种实用的缓解策略，包括酸化、碱化和硝化（Liu等，2024；Martin等，2022；Maurer等，2006；Wang等，2024）。

传统的尿液储存方法通过尿素水解过程中的pH值升高来降低病原微生物风险，但需要较长时间并且会导致大量氮损失。世界卫生组织（WHO）建议新鲜尿液在社区区域使用前的储存时间为1至6个月（WHO，2006）。向尿液中添加碱可以显著加速这一卫生处理过程，但由此产生的高pH值环境会促进尿液收集管道中碱性矿物（如羟基磷灰石、鸟粪石和方解石）和磷酸盐的沉淀，增加了堵塞风险（Simha等，2025）。为了规避这一问题，以特定浓度酸化尿液不仅可以抑制尿素分解，还能在短时间内灭活多种病原体（Crane等，2024；Saetta等，2020；Simha等，2023）。尿液的硝化是另一种有效的处理方法，但面临着高氨浓度、高盐度和pH值大幅波动的挑战，使得反应器启动时间较长且稳定运行困难（Faust等，2024；Wang等，2024）。

农业酵素（AJ）是由厨房废弃物、糖和水按照3:1:10的比例混合发酵3个月制成的（Gao等，2022；Zhang等，2020）。成熟的AJ富含水解酶、有机酸和其他活性物质（Gao等，2023）。由于富含有机酸（如醋酸AA和乳酸LA），AJ的pH值通常低于4.0。乳酸菌（LAB）、醋酸菌（AAB）和酵母菌是AJ中的优势微生物（Zhang等，2020）。农民容易学习，在农业和环境领域有广泛应用。研究发现，使用AJ有助于通过刺激作物的次级代谢来促进作物品质并减少对农药的依赖（Cheng等，2023；Gao等，2022；Hao等，2024）。

据报道，尿液可以通过接种乳酸菌占优势的泡菜汁进行发酵（Andreev等，2017）。本研究实验结果表明，尿液pH值升高效被有效抑制，萝卜发芽率显著改善。然而，发酵过程和微生物演替未被研究。据报道，AJ中的优势微生物（LAB和AAB）与有机酸结合，对病原体表现出强烈的抗菌活性（Zhang等，2020）。Xu等（2023）通过用AJ发酵沼渣来提高其农业品质。研究发现，沼渣农业品质的改善与其微生物群落的富集密切相关。

据作者所知，文献中尚未报道使用AJ和糖蜜（本研究作为碳源）发酵尿液。此外，据报道酵母菌与LAB一起大量繁殖。这种共存得益于碳资源利用和多种代谢过程的协同作用，包括嘌呤、氨基酸和长链脂肪酸的代谢，以及铁的摄取和环境改造（Mendes等，2013；Zhang等，2021）。然而，之前的研究并未关注真菌群落在尿液发酵中的作用。本研究的目标是：(1) 研究不同剂量的AJ和糖蜜发酵尿液对脲酶和病原体灭活的影响；(2) 定量分析发酵过程中氮、微生物群落（细菌和真菌）和有机酸的动态变化，以优化发酵条件。此外，我们尝试解释观察到的发酵参数变化。

2. 材料与方法

2.1. AJ、糖蜜和尿液

本研究使用的AJ由菠萝皮、红糖和水按照3:1:10的比例制成。三种材料在密闭塑料箱中混合并储存5个月。实验前从制造商处购买了一瓶新鲜糖蜜。AJ、糖蜜和新鲜尿液的性质列于表1。尿液通过放置在浙江大学科技园楼内男厕的两个带有自愿收集标签的容器收集。经过两天的收集期后，收集的尿液混合用于实验。

表1. AJ、糖蜜和新鲜尿液的性质

| 参数 | 单位 | AJ | 糖蜜 | 新鲜尿液 |
|------|------|----|------|----------|
| pH | \ | 3.31 | 5.31 | 7.14 |
| SC | % | — | 34.66 | — |
| RSC | % | — | 14.79 | — |
| CODCr | mg/L | 954 | 28.31 | 09174 |
| TAN | mg/L | 4.7 | 8.2 | 081.0 |
| NN | mg/L | 9.3 | 3 | 08.4 |
| FAN | mg/L | 1 | 08.4 | 6 |
| LA | g/L | 98.2 | 2165 | <0.20 |
| AA | g/L | 58.7 | 100 | <0.10 |
| LAB | CFU/mL | 4.25 | 3.57 | — |
| AAB | CFU/mL | 5.57 | 4.76 | — |
| Yeast | CFU/mL | 5.8E+6 | <100 | — |
| | | 1.1E+5 | <100 | — |
| | | 2.5E+3 | <10 | — |

SC，蔗糖含量，由制造商提供；RSC，还原糖含量，由制造商提供；CODCr，用重铬酸钾法测定的化学需氧量；TAN，用纳氏试剂分光光度法测定的总氨氮；NN，用紫外分光光度法测定的硝酸盐氮；FAN，通过公式(2)计算的游离氨氮；LA，用高效液相色谱法测定的乳酸；AA，用高效液相色谱法测定的醋酸；LAB，用平板计数法测定的乳酸菌；AAB，用平板计数法测定的醋酸菌。

2.2. 发酵实验

设计了四组以测试小规模实验中不同糖蜜剂量的影响。四组材料列于表2。每组重复三次。对于每组，所有材料在350 mL塑料瓶中混合并密封。然后，所有瓶子静置在25°C恒温房间中31天。

表2. 小规模实验四组的材料

| 材料 | M-0%（mL） | M-3%（mL） | M-5%（mL） | U（mL） |
|------|------------|------------|------------|---------|
| 尿液 | 250 | 250 | 250 | 300 |
| AJ | 50 | 42.5 | 37.5 | 0 |
| 糖蜜 | 0 | 7.5 | 12.5 | 0 |
| 总体积 | 300 | 300 | 300 | 300 |

另一个更大规模的实验进行了以测试该方法的实际可行性。尿液在5 L发酵桶中收集了三天，为防止尿液水解，每天添加10% (v/v)的AJ。最终收集了3.5 L尿液并添加了350 mL AJ。然后添加70 mL糖蜜并混合。桶盖紧并静置在25°C恒温房间中40天。

2.3. 发芽试验

为了评估尿液发酵液对作物的安全性，我们选择了第31天的M-3%组，将其稀释100倍、200倍和300倍，然后进行发芽试验。纯尿液组也按相同比例稀释并进行比较测试。每个培养皿底部铺有滤纸，加入4 mL稀释液和20粒萝卜种子。萝卜种子首先浸泡在3% (v/v)次氯酸钠溶液中2分钟，然后用纯水冲洗五次，最后放入培养皿中。培养皿放在25°C的孵化箱中2天。每个稀释组进行三次重复测试。发芽指数（GI）计算如下：

$$\text{GI} = \frac{G_t \times L_t}{G_c \times L_c} \times 100 \tag{1}$$

其中Gt和Gc分别是处理组和对照组（纯水）的发芽种子数量；Lt和Lc分别是处理组和对照组的平均幼苗长度。

2.4. 化学分析

实验溶液的pH值使用HACH pH计（HQ40D，HACH公司，美国）测量。总氨氮（TAN）浓度使用纳氏试剂分光光度法在420 nm处测定。硝酸盐氮（NN）浓度使用紫外分光光度法（UV法）在220 nm处测定，并在275 nm处校正背景干扰。测量TAN和NN之前，实验溶液用纯水稀释200倍。游离氨氮（FAN）浓度通过以下公式计算（Hansen等，1998）：

$$\text{FAN} = \frac{\text{TAN}}{1 + \frac{1 + 10^{-pH}}{10^{-(0.09018 + \frac{2729.92}{T})}}} \tag{2}$$

其中T是以开尔文为单位的绝对温度，TAN和FAN均以mg/L表示。

LA和AA含量使用高效液相色谱法（HPLC；Leaps型号，Chromai，北京，中国）测定。每个样品（10 mL）在11,000 rpm下离心10分钟，稀释10倍，然后通过0.22 μm注射器过滤器过滤后进行进样。色谱分离在反相C18柱上进行（Ultimate LP-C18，5 μm，4.6×250 mm；Welch Materials，上海，中国）。流动相由0.01 mol/L磷酸二氢钾组成，使用磷酸将pH值调节至2.5。柱温维持在30°C。进样量为10 μL，流速为1.0 mL/min，每个样品运行时间为17分钟。

2.5. Illumina测序

为了确定小规模实验溶液中微生物群落的绝对丰度，进行了绝对定量16S rRNA基因测序和绝对定量ITS测序。对于每个样品，10 mL溶液在11,000 rpm下离心10分钟。离心沉淀物冷冻后交付给上海美吉生物医药科技有限公司。使用DNA试剂盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，美国）从三个独立重复样品中各提取一次DNA。将12个不同的spike-in序列，每个在四个不同浓度（103，10?，10?，10?拷贝）下添加到样品DNA池中。这些spike-in序列具有与特定天然16S rRNA基因相同的保守区域，但其可变区域是合成的，与公共数据库条目共享的核苷酸序列一致性很低。作为内标，这些spike-in使分析样品能够实现绝对定量。

对于绝对定量16S rRNA测序，使用引物对341F和806R扩增高变V3-V4区域，使用GeneAmp? PCR System 9700热循环仪（Applied Biosystems?，Thermo Fisher Scientific，美国）。对于绝对定量ITS测序，使用真菌特异性引物对ITS1F和ITS2R进行扩增。PCR扩增方案包括以下步骤：在95°C下初始变性3分钟；然后进行27个循环，包括95°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸45秒；最后在72°C下延伸10分钟；并在4°C下终止保存。纯化的扩增子在等摩尔比例下混合，并在Illumina NextSeq 2000平台（Illumina，San Diego，CA，美国）上进行双端测序。原始FASTQ文件使用fastp（v0.19.6）进行质量过滤，滑动窗口为50 bp，最低平均质量得分为20，丢弃长度小于50 bp或包含模糊碱基的读数。只有当重叠序列超过10 bp且错配率≤20%时，成对读数才通过FLASH（v1.2.7）合并，样品使用精确条形码匹配和解复用，允许最多2个碱基的引物错配。

OTU（操作分类单元）的分类归属通过 QIIME2 中的朴素贝叶斯共识分类器进行，利用了 SILVA 16S rRNA 数据库（v138）和 UNITE ITS 数据库（v9.0）。使用 Majorbio Cloud 平台（www.majorbio.com）进行微生物数据分析（Zhao 等，2026）。对于 5 升桶的发酵液，进行 16S rRNA 测序以确定其相对丰度。使用引物对 341F 和 806R 扩增细菌 16S rRNA 基因的高变 V3-V4 区域。

2.6. 病原体指标
在本研究中，开发了一种病原体指标来量化样本中的总病原体水平，如公式（3）所示。
(3) $PLI = \frac{1}{T} \sum_{i=1}^{n} \omega_i \times A_i$
其中 $A_i$ 是风险微生物的绝对测序丰度，$\omega_i$ 是其权重系数；i 是本研究中选定的风险微生物数量；T 是用于修正结果的参考值。

2.7. 数据分析
数据处理和统计分析使用 WPS Excel 和 Matlab 进行。单因素方差分析 (ANOVA) 后接 Duncan 多重范围检验用于确定处理间差异的显著性，显著性阈值设为 P < 0.05。图表使用 Matlab 绘制。

3. 结果
3.1. 发酵对尿液 pH 值和不同形态氮的影响
图 1 (a) 表明，AJ 和糖蜜补充显著降低了发酵液在前五天期间的 pH 值。添加 3% 和 5% 糖蜜的 pH 值分别降低了 1.5 和 1.6 个单位。在此初始下降之后，pH 值随时间保持恒定，表明尿素水解被有效抑制。相比之下，纯尿液的 pH 值在 31 天内稳步上升，总增加超过 2.0 个单位，表明强烈的尿素水解过程。在本实验之前，我们进行了三次预测试。虽然在本实验中观察到纯 AJ 添加处理略有 pH 下降，但在我们的预测试中并不稳定。我们在表 S1 中的预测试表明，添加纯 AJ 并将尿液初始 pH 值调整至 5.0 左右通常可以抑制 pH 值上升，但也出现过一次失败案例。这可能是因为在 pH 5.0 时脲酶活性无法被完全抑制。图 1 (a) 中的数据表明，当同时添加糖蜜作为发酵碳源时，不需要将尿液初始 pH 值调整至 5.0，这意味着可以显著减少酸的添加量。
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图 1. 实验溶液随发酵时间变化的 (a) pH 值，(b) TAN，(c) FAN，(d) NN（使用标准误差条）。
缩写：TAN，总氨氮；TG FAN，处理组的游离氨氮；CG FAN，对照组的游离氨氮；NN，硝态氮。
如图 1 (b) 所示，纯尿液组表现出 267.1% 的 TAN 增加，这与图 1 (a) 中观察到的 pH 值急剧增加一致。相比之下，添加 AJ，无论是单独添加还是与糖蜜结合，都降低了 TAN 浓度。到第 31 天，与初始水平相比，TAN 在 0%、3% 和 5% 糖蜜（加 AJ）组中分别减少了 49.3%、48.1% 和 39.7%。需要注意的是，虽然纯 AJ 添加在本实验中显著降低了 TAN，但我们的预测试表明可能出现相反的结果（急剧增加）。由于 TAN 增加会驱动 pH 值上升，表 S1 中 pH 值的快速增加意味着 TAN 也有类似的巨大增加。这意味着当使用纯 AJ 将尿液初始 pH 值调整至 5.0 时，脲酶活性没有得到有效灭活。如图 1 (d) 所示，所有组别都观察到轻微的 NN 下降，变化趋势相似。
如图 1 (c) 所示，添加糖蜜和 AJ 后，其 FAN 浓度在五天内容易降至 0.001 mg/L 以下，随后保持稳定。与纯尿液的初始 FAN 相比，处理组的 FAN 在第 10 天减少至其 0.4%。相应地，强烈的氨味在第 5 天基本消除，取而代之的是可能来自有机酸和乙醇的酸甜气味。相比之下，纯尿液的 FAN 水平在第 31 天飙升至超过 2300 mg/L，伴随着强烈的氨味。

3.2. 有机酸（LA 和 AA）随时间的变化
LA 和 AA 通常在 AJ 发酵中大量产生（Gao 等，2023）。有趣的是，这种现象在我们的尿液发酵中也观察到，尽管我们实验中的主要氮源是无机的。如图 2 所示，在第 5 天，M-0%、M-3% 和 M-5% 组的 LA 浓度分别增加了 98.7%、732.3% 和 818.6%。相应地，AA 浓度增加了 7.9%、170.5% 和 188.3%。LA 在第 15 天达到峰值产率，浓度分别为 M-0%、M-3% 和 M-5% 组中的 2.2、9.5 和 13.1 g/L。这一观察结果与某些 AJ 发酵过程报告的发现一致（Gao 等，2024）。之后，LA 被连续转化为 AA 和其他产物，导致 AA 浓度在第 31 天达到最大值（三个处理组分别为 1.1、2.5 和 2.9 g/L）。第 31 天三个处理组的总酸度（以 LA 表示以便与文献数据比较）分别达到 3.7、12.3 和 16.4 g/L。M-3% 和 M-5% 组的总酸度值与成熟 AJ 中的值相当（Gao 等，2023；Zhang 等，2020）。
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图 2. 实验溶液随发酵时间变化的 (a) LA 和 (b) AA。
缩写：LA，乳酸；AA，乙酸。

3.3. 微生物演变和病原体灭活
使用 Bray-Curtis 算法对 16S rRNA 测序结果进行了非度量多维尺度分析 (NMDS)。如图 3 所示，四个实验组随时间演变成了三个不同的群落。具体来说，M-3% 和 M-5% 组的群落在第 5 天后变得紧密聚集，而另外两个组独立发展成两个分离的群落。这表明单独添加 AJ 改变了尿液细菌群落，而糖蜜和 AJ 的联合添加使其向不同方向转变。此外，所有组的群落都在第 5 天稳定下来，随后变化很小。这种稳定在 M-3% 组中最为明显，表明与纯尿液组相比，添加 3% 糖蜜加速了微生物群落的稳定。
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图 3. 不同时间组样本在 OTU 水平上的非度量多维尺度分析 (NMDS)，应力值为 0.05，R = 0.87，P = 0.01。
组名编码如下：M0_0，第 0 天添加 0% 糖蜜组；M3_0，第 0 天添加 3% 糖蜜组；M5_0，第 0 天添加 5% 糖蜜组；U_0，第 0 天纯尿液组。其他组遵循相同的命名模式。
图 4 展示了实验组细菌绝对丰度在 15 天内的演变。就总丰度而言，单独添加 AJ 使从第 0 天起其总丰度降至纯尿液组的 1%。AJ 和糖蜜的联合添加（M-3% 和 M-5%）导致 15 天内持续增加。鉴于所有组的细菌群落在第 5 天已基本稳定，因此选择了第 5 天的群落进行比较，如图 5 所示。从图中可以看出，LAB 在 M-3% 组和 M-5% 组中都是压倒性的优势群落。就 LAB 总丰度而言，到第 10 天，添加糖蜜组（M-3% 和 M-5%）的 LAB 总丰度比初始混合物增加了一个数量级。相比之下，潜在病原体（如克氏柠檬酸杆菌属、肠球菌属、葡萄球菌属等）和尿液中的其他原始微生物在处理组中被强烈抑制至非常低的丰度水平（低于 2%）。
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图 4. 不同时间处理组在属水平上的细菌群落绝对丰度。
组名编码如下：M0_0，第 0 天添加 0% 糖蜜组；M3_0，第 0 天添加 3% 糖蜜组；M5_0，第 0 天添加 5% 糖蜜组；U_0，第 0 天纯尿液组。其他组遵循相同的命名模式。
缩写：Lent.，小乳杆菌属 (Lentilactobacillus)；Acet.，醋杆菌属 (Acetobacter)；Alca.，无色杆菌属 (Alcaligenes)；Schl.，施莱弗乳杆菌属 (Schleiferilactobacillus)；Lach.，无芽孢梭菌属 (Lachnoclostridium)；Lactip.，植物乳杆菌属 (Lactiplantibacillus)；Bact.，拟杆菌属 (Bacteroides)；Limo.，极限乳杆菌属 (Limosilactobacillus)；Weis.，魏斯氏菌属 (Weissella)；Faec.，粪杆菌属 (Faecalicatena)；Aero.，气孪球菌属 (Aerococcus)；O.Lactob.，未分类_o_乳杆菌目 (unclassified_o_Lactobacillales)；Paen.，类芽孢杆菌属 (Paenibacillus)；Lactoc.，乳球菌属 (Lactococcus)；Serr.，沙雷菌属 (Serratia)；Citr.，克氏柠檬酸杆菌属 (Citrobacter)；Lactic.，乳乳杆菌属 (Lacticaseibacillus)；Enteroc.，肠球菌属 (Enterococcus)；Fack.，法克兰氏菌属 (Facklamia)；Jeot.，发酵乳杆菌属 (Jeotgalibaca)；Stap.，葡萄球菌属 (Staphylococcus)；Enterob.，未分类_f_肠杆菌科 (unclassified_f_Enterobacteriaceae)；Desu.，脱硫杆菌属 (Desulfuribacillus)；F.Lactob.，未分类_f_乳杆菌科 (unclassified_f_Lactobacillaceae)。
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图 5. 第 5 天所有实验组在属水平上的细菌群落比较。
组名编码如下：M0_5，第 5 天添加 0% 糖蜜组；M3_5，第 5 天添加 3% 糖蜜组；M5_5，第 5 天添加 5% 糖蜜组；U_5，第 5 天纯尿液组。
缩写：Lent.，小乳杆菌属 (Lentilactobacillus)；Bact.，拟杆菌属 (Bacteroides)；Citr.，克氏柠檬酸杆菌属 (Citrobacter)；Lactic.，乳乳杆菌属 (Lacticaseibacillus)；Enteroc.，肠球菌属 (Enterococcus)；Lactoc.，乳球菌属 (Lactococcus)；Schl.，施莱弗乳杆菌属 (Schleiferilactobacillus)；Stap.，葡萄球菌属 (Staphylococcus)；Lactip.，植物乳杆菌属 (Lactiplantibacillus)；Weis.，魏斯氏菌属 (Weissella)。
本实验中的 LAB（乳酸菌）包括 Lent.、Lactic.、Lactoc.、Schl.、Stap.、Lactip. 和 Weis.。
图 6 展示了实验组真菌绝对丰度在 15 天内的演变。与初始丰度相比，M-3% 和 M-5% 组从第 5 天起绝对丰度增加了一个数量级，这表明真菌生长需要额外的碳源。
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图 6. 不同时间处理组在属水平上的真菌群落绝对丰度。
组名编码如下：M0_0，第 0 天添加 0% 糖蜜组；M3_0，第 0 天添加 3% 糖蜜组；M5_0，第 0 天添加 5% 糖蜜组；U_0，第 0 天纯尿液组。其他组遵循相同的命名模式。
使用属水平上的 16S rRNA 基因绝对定量测序结果，选择了六种高风险属来计算每个样本的病原体指标 (PLI)。选择的属为假单胞菌属、肠球菌属、葡萄球菌属、克氏柠檬酸杆菌属、沙雷菌属和梭菌属。基于其各自的致病性和传播风险水平，所选属的权重系数分别设为 5、5、4、4、4 和 4（Dumontet 等，2001；Flores and Rohn, 2025；Xu 等，2022）。如表 3 所示，第 0 天时，处理组（M-0% 和 M-3%）的 PLI 结果与对照组（U）之间没有显著差异。第 0 天时 M-5% 与其他组之间的显著差异表明，添加糖蜜可以改善初始时间病原体的演替。这可能是因为在添加碳源后，初始 pH 值不是非常低，因此初始环境适合病原体的演替。从第 5 天及以后，与第 0 天相比，处理组的 PLI 结果减少，而对照组增加。处理组与对照组之间的差异显著。

表 3. 不同时间处理组的病原体指标 PLI。
处理 | 第 0 天 | 第 5 天 | 第 10 天 | 第 15 天
---|---|---|---|---
M-0% | 0.26 ± 0.17a | 0.30 ± 0.17a | 0.09 ± 0.03a | 0.03 ± 0.01a
M-3% | 33.61 ± 33.16a | 4.67 ± 2.09a | 4.30 ± 2.05a | 4.33 ± 3.43a
M-5% | 88.08 ± 12.31b | 4.82 ± 2.02a | 7.33 ± 5.80a | 8.55 ± 5.57a
U | 3.35 ± 0.99a | 653.92 ± 277.62b | 539.20 ± 404.59b | 345.37 ± 126.59b
数据以均值 ± 标准差 (SD) 表示。在同一列中，上标小写字母表示显著差异 (P < 0.05)。

3.4. 发酵对种子发芽的影响
表 4 表明，随着稀释倍数的增加，M-3% 组的 GI 增加，从 100 倍稀释时的 82.8% 上升到 300 倍稀释时的 93.0%。相比之下，纯尿液组的 GI 没有表现出随着稀释倍数增加而增加的趋势。这可能是由于发酵液中有机酸对种子发芽的抑制作用随着稀释倍数的增加而降低。

表 4. 发芽测试结果。
组别 | 稀释倍数 | GI (%)
---|---|---
M3 | 100 | 82.8 ± 13.6
M3 | 200 | 90.1 ± 8.9
M3 | 300 | 93.0 ± 3.7
U | 100 | 92.4 ± 14.3
U | 200 | 85.8 ± 17.5
U | 300 | 91.9 ± 15.0
M3-100：3% 糖蜜添加组稀释 100 倍；U-100：纯尿液组稀释 100 倍；其他以同样的方式命名。
数据以均值 ± 标准差表示。

3.5. 5 升发酵桶的实验结果
图 7(a) 显示，在整个发酵期间，FAN 浓度保持在低于 0.01 mg/L 的低水平。与纯尿液的初始 FAN 相比，处理组的 FAN 在第 10 天减少至约 4.8%。

如图 7(b) 所示，乳酸菌 (LAB) 在第 10 天的发酵液中占据主导地位，相对丰度约为 93%。真实比例可能更高，因为 16S rRNA 测序中也包括了死亡的微生物。因此，较大规模实验也证明了发酵对脲酶活性和病原体丰度的抑制作用。本实验中添加的农业酵素 (AJ) 和糖蜜量小于小规模实验，因为本实验尿液的初始 pH 值要低得多 (5.58 对比 7.14)。

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图 7. 5 L 发酵桶的实验结果：(a) 第 0、10 和 40 天的 TAN、NN 和 FAN；(b) 第 0 天和第 10 天的细菌群落。
缩写：TAN, 总氨氮；NN, 硝酸盐氮；FAN, 游离氨氮。

4. 讨论
4.1. 处理组中的 pH 降低
在新鲜尿液中，尿素中的氮占总氮的 75% 至 90% (Rose 等，2015)。然而，尿素很容易被常见于尿液和环境中的脲酶水解成氨 (NH3) 和二氧化碳 (CO2)。产生的氨随后在水中解离形成铵离子 (NH4+) 和氢氧根离子 (OH?)，从而提高溶液的 pH 值。铵离子浓度的增加会导致溶液中游离氨 (NH3) 水平升高。这种游离氨极易挥发，容易逸散到大气中，污染周围环境并导致尿液氮损失。需要注意的是，尿素水解是一个不可逆过程，因此在其早期阶段进行及时干预至关重要。在本研究中，通过低 pH 环境有效抑制了处理组中的脲酶活性，防止了 TAN 浓度和 pH 的升高。

我们自然推测，M-3% 和 M-5% 组中 pH 的剧烈降低可能主要归因于有机酸 (乳酸和乙酸) 的增加或 TAN 的降低。如表 5 中的数据所示，对于 M-0% 组，29.60 mmol/L 的 TAN 降低和 10.19 mmol/L 的总有机酸增加仅导致 0.23 的 pH 降低。M-0% 和 M-5% 组的比较显示，TAN 降低的差异仅为 2.34 mmol/L。相比之下，总有机酸增加的差异为 94.6 mmol/L，导致 pH 额外降低 1.36。比较表明，有机酸增加可能在 pH 降低中起更重要作用。M-3% 和 M-5% 组的比较显示，虽然 M-3% 组的总有机酸增加比 M-5% 组低 17.58 mmol/L，但 pH 降低的差异仅为 0.09。这表明 M-3% 和 M-5% 组在低 pH 下具有强大的 pH 缓冲能力。

表 5. 前 5 天 pH、TAN、LA 和 AA 的平均变化。
组别 pH_0 pH 降低 TAN 降低 (mmol/L) LA 增加 (mmol/L) AA 增加 (mmol/L)
M-0% 5.08 0.23 29.60 9.16 1.03
M-3% 5.31 1.50 51.62 68.90 18.31
M-5% 5.42 1.59 27.26 82.38 22.41
pH_0, 第 0 天的 pH；TAN, 总氨氮；LA, 乳酸；AA, 乙酸。

4.2. 尿液发酵中的氮源和共培养
处理组中观察到的 TAN 降低可能归因于整个发酵期间的氮同化，以及最初几天溶解氧 (DO) 相对较高时嗜酸氨氧化菌 (AOB) 的氨氧化作用 (Faust 等，2024)。鉴于处理组中氨基酸较低，氨氮可能在发酵过程中被同化作为氮源。如图 S1 所示，M-3% 和 M-5% 组中氨同化基因 (gdhA 和 gltB) 的相对丰度在第 10 天显著高于纯尿液组，表明 M-3% 和 M-5% 组中的氨同化得到了增强。gdhA 和 gltB 基因分别负责谷氨酸脱氢酶 (GDH) 途径和谷氨酰胺合成酶 - 谷氨酸合成酶 (GS-GOGAT) 循环。gdhA 基因的主要宿主是柠檬乳杆菌属 (Lentilactobacillus spp.)、乳酪乳杆菌属 (Lacticaseibacillus spp.) 和植物乳杆菌属 (Lactiplantibacillus spp.)，而 gltB 基因主要由柠檬乳杆菌属 (Lentilactobacillus spp.)、乳酪乳杆菌属 (Lacticaseibacillus spp.) 和乳球菌属 (Lactococcus spp.) 贡献 (如图 S2 所示)。上述微生物均属于乳酸菌。

虽然乳酸菌可以同化氨氮产生一些细胞增殖所需的氨基酸，但它们无法产生生长所需的所有氨基酸。这意味着含有氨基酸的有机氮源对于乳酸菌的生长仍然是必不可少的 (Canon 等，2021)。除了糖蜜和 AJ 中可用的氨基酸外，酵母可以溢出氨基酸供乳酸菌使用 (Gabrielli 等，2023；Ponomarova 等，2017)。据报道，酵母和乳酸菌的共培养通过合作利用碳资源，以及在嘌呤、氨基酸和长链脂肪酸代谢、铁摄取和环境改造方面的合作，促进两株菌的生长 (Mendes 等，2013；Zhang 等，2021)。如图 8 所示，毕赤酵母属 (Pichia spp.) 的绝对丰度与乳酸菌和醋酸菌 (AAB) 的绝对丰度强相关，且具有高度显著性差异 (对于大多数乳酸菌，R > 0.76，P < 0.001)。这种强正相关表明毕赤酵母属和乳酸菌之间可能存在交叉喂养相互作用。

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图 8. 细菌属丰度与相关因子之间的 Spearman 相关性热图 (* P < 0.01)
缩写：TAN, 总氨氮；NN, 硝酸盐氮；LA, 乳酸；AA, 乙酸；Lactoc., 乳球菌属；O.Lactob., 未分类的乳杆菌目；Schl., 施莱费尔乳杆菌属；Lactic., 乳酪乳杆菌属；Lent., 柠檬乳杆菌属；Lactip., 植物乳杆菌属；Limo., 嗜黏蛋白乳杆菌属；Weis., 魏斯氏菌属；Acet., 醋杆菌属；Alca., 产碱杆菌属；Enteroc., 肠球菌属；Citr., 柠檬酸杆菌属；Serr., 沙雷杆菌属；Pseu., 假单胞菌属；Desu., 脱硫杆菌属；Bact., 拟杆菌属；Jeot., 腌渍乳杆菌属；Fack., 法氏菌属；Paen., 类芽孢杆菌属；Lach., 无梭杆菌属；Faec., 粪链球菌属；Aero., 气杆菌属；F.Lactob., 未分类的乳杆菌科；Stap., 葡萄球菌属；Enterob., 未分类的肠杆菌科。

4.3. 糖蜜添加
在本研究中，添加更多糖蜜导致有机酸产量增加 (图 2)，以及从第 10 天起乳酸菌种群更大 (图 4)。然而，这也略微增加了 PLI 值 (表 3)。这可能是因为随着碳源增加，病原体也生长得更多，导致对应于糖蜜剂量的不同细菌群落，如图 3 所示。

M-3% 和 M-5% 组的总糖浓度分别为 17.80 g/L 和 29.67 g/L。如表 S2 所示，与前 15 天 M-5% 组相比，M-3% 组的 LA 和 AA 产品收率更高。M-3% 组 LA 的最大收率为第 15 天的 0.484 g/g。第 10 天，LA 和 AA 的收率分别已达到第 15 天值的 82.6% 和 95.8%。出于经济高效运行的考虑，推荐 3% 的糖蜜浓度和 10 天的发酵周期。尽管 5 L 桶发酵实验使用了 2% 的糖蜜，但这仅适用于尿液初始 pH 较低的情况。为了更广泛的适用性，推荐使用 3% 的糖蜜。如表 S3 所示，本文提出的尿液发酵方法在发酵周期和糖蜜添加方面优于文献中的方法。

4.4. 发酵产物的潜在农业价值
使用农业酵素 (AJ) 和糖蜜发酵尿液的产物不仅保留了尿液中必需的肥料养分 (包括大量元素和微量元素)，还丰富了来自 AJ 的有机酸 (乳酸和乙酸) 和有益微生物 (乳酸菌和酵母)。这些物质对于作物生长和土壤健康都至关重要。此外，尿液酸化可以保留更多的可溶性磷——这是作物根系吸收磷的主要形式——从而提高磷的利用率。Martin 等人 (2021) 调查了九种人尿液基肥料的氮利用率，发现其效率接近矿物肥料。田间实验和农民访谈表明，尿液被视为一种低成本、低风险的肥料，有助于玉米、高粱、芥菜和南瓜等作物产量的显著增加 (Andersson, 2015; Pradhan 等，2011)。Johansen 等人 (2023) 检查了使用人尿液施肥超过十年的土壤中的线虫指数 (用于指示新兴污染物的影响)，发现长期施肥对土壤线虫指数没有显著影响。与尿液肥料相关的风险，即盐渍化和氨氮升高，可以通过适当的稀释等措施加以管理 (Musazura 和 Odindo, 2022)。至于 AJ 的农业应用，文献中可以找到各种论文 (Gao 等，2022；Gattupalli 等，2024；Xu 等，2023)。使用 AJ 和糖蜜发酵尿液的产物可能保留尿液肥料和 AJ 两者的优势，有望成为一种环保型生物肥料。为减少发酵尿液中有机酸对作物生长的抑制作用——类似农业中 AJ 的情况——适当的稀释是必要的。根据发芽试验结果，建议至少稀释 100 倍，这与 AJ 的用法相似。

5. 结论
本研究通过小规模和大规模实验证明了使用农业酵素 (AJ) 和糖蜜发酵尿液的可行性。在处理组中，第 5 天实现了游离氨的大幅降低和病原体的显著抑制，并在此后保持持续。到第 10 天，乳酸菌 (LAB) 和毕赤酵母属 (Pichia spp.) 酵母的绝对丰度均增加了一个数量级。两者之间存在强正相关，且具有高度显著性差异 (对于大多数乳酸菌，R > 0.76，P < 0.001)。相比之下，尿液中的本土微生物，包括病原体，的丰度大幅降低 (绝对丰度低于 2%，相对丰度低于 7%)。从效率和经济角度来看，推荐使用 3% 的糖蜜添加量和 10 天的发酵周期。

成分分析表明，发酵产物是一种更安全的尿液 -AJ 混合 blend。它不仅保留了尿液中的肥料养分 (例如氮、磷、钾和微量元素)，还丰富了来自 AJ 的活性物质 (例如乳酸菌、酵母) 和有机酸 (乳酸、乙酸)。当适当稀释时，这些成分对作物和土壤都有益处。本研究提供了一种环保方法来处理厨余垃圾和源头分离尿液，在分散式农村卫生和农业生物肥料生产方面具有潜在应用。

CRediT 作者贡献声明
杨静：撰写 - 初稿，调查，数据管理，构思。
游赖永：撰写 - 审阅与编辑，验证，方法学。
王伟：方法学，数据管理。
林新达：验证，监督。
李军：验证，监督，资源，项目管理，资金获取。

杨静 | 游赖永 | 王伟 | 林新达 | 李军