《International Biodeterioration & Biodegradation》：Quantification of subaerial algae on building materials by a new standardised imaging Pulse-Amplitude-Modulation Fluorometry (PAM-F) method
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摘要翻译：
亚气生生物膜（SABs）是密集堆积的微生物群落，形成于固体表面与大气之间的边界处。它们对极端胁迫的显著耐受能力使其能够在最严苛的环境中生存，从而成为陆地环境的普遍定殖者。研究人员开发了一种标准化、可复现的成像脉冲振幅调制荧光法（Imaging Pu
摘要翻译：
亚气生生物膜（SABs）是密集堆积的微生物群落，形成于固体表面与大气之间的边界处。它们对极端胁迫的显著耐受能力使其能够在最严苛的环境中生存，从而成为陆地环境的普遍定殖者。研究人员开发了一种标准化、可复现的成像脉冲振幅调制荧光法（Imaging Pulse-Amplitude-Modulation Fluorometry, Imaging PAM-F）方案，用于量化建筑材料上的亚气生藻类生物量。研究系统评估了软件测量设置（测量光强度ML和增益G）对F0信号的影响，并提出了一种基于数据驱动的可定制评估算法，以客观选择最优设置并构建校准曲线。以新分离的亚气生绿藻Jaagichlorella sp.为测试生物，在聚碳酸酯膜、混凝土颗粒和 marble 颗粒（白色卡拉拉大理石颗粒）三种基质上建立了藻细胞密度与F0信号之间的线性校准曲线。结果表明，基质的反射率和光学性质显著影响荧光信号强度：marble颗粒因高反射率而易于出现过饱和，而混凝土颗粒和聚碳酸酯膜在低藻密度下易出现欠饱和。校准曲线显示出基质特异性，因此测量设置不能在不同材料间直接转移。该标准化框架提高了成像PAM-F测量的可重复性和跨研究可比性，为建筑材料生物可接受性（bioreceptivity）的定量评估提供了可靠工具。研究证实Jaagichlorella sp.在长时间测量中F0和Fv/Fm信号稳定，适合作为参考测试菌株。该方法的建立为早期微生物定殖的定量监测和建筑材料性能评估提供了标准化途径。
论文解读文章
研究背景与问题
亚气生生物膜（subaerial biofilms, SABs）是形成于固体表面与大气界面处的密集微生物群落，具有极强的环境胁迫耐受性，广泛定殖于各类陆地表面。在建筑材料领域，对生物可接受性（bioreceptivity）的研究日益受到关注，其定义为材料被微生物定殖的潜在能力。传统建筑材料通常追求低生物可接受性以保持表面清洁，但近年来出现了利用高生物可接受性材料进行垂直绿化或生物多样性建筑的互补趋势。同时，在文化遗产保护中，理解并预防生物劣化过程对保存历史建筑表面至关重要。因此，无论出于防护工程、绿色城市设计还是遗产保护的目的，都需要能够灵敏、非破坏性且标准化地量化早期微生物定殖的方法。对于光合微生物，叶绿素荧光技术是一种理想手段；其中脉冲振幅调制荧光法（Pulse-Amplitude-Modulation Fluorometry, PAM-F）自20世纪80年代引入后，已被证明可用于检测早期定殖和监测光合生物膜。然而，其广泛应用受到诸多限制：不同设备的光学系统、工作距离、光波长和强度、软件配置存在差异；测量设置缺乏统一标准；已发表研究常缺少可复现性所需的详细文档；基质本身的光学与物理性质（如反射率、孔隙率、润湿性）会显著影响荧光信号但常被忽略。此外，水可用性、光照和温度等外部参数也会影响光合活性，进而影响PAM-F测量质量。尽管已有少数研究尝试建立F0信号与藻类细胞密度之间的校准曲线，但迄今尚无研究系统描述一种能够客观、自动选择设备软件设置的标准化校准方法。因此，研究人员旨在开发一种可复现的成像PAM-F定量方案，用于建筑材料生物可接受性研究。
研究内容与结论
研究人员开发了一套完整的标准化流程，涵盖培养、样品制备、测量配置和软件设置的系统探索。以从柏林建筑外墙面分离的亚气生绿藻Jaagichlorella sp.作为代表性测试生物，在聚碳酸酯膜、混凝土颗粒和大理石颗粒三种基质上进行了接种和测量。研究人员编写了一个基于Python的可定制评估算法，通过数据驱动方式自动选择最可靠的软件测量设置并生成校准曲线。结果表明，该算法能够有效识别欠饱和与过饱和区域，并选出每种基质和浓度范围对应的最优测量光强度（ML）和增益（G）组合。所有校准曲线均呈现线性关系，R2值高于0.986。研究证实基质性质（尤其是反射率）直接影响成像PAM-F信号：大理石颗粒反射率最高，容易出现过饱和；混凝土颗粒反射率最低，在低藻密度时易出现欠饱和；聚碳酸酯膜介于两者之间。因此，测量设置和校准曲线具有基质特异性，不能在不同材料间直接转移。研究还证实Jaagichlorella sp.在8小时测量期间F0信号强度和Fv/Fm信号面积保持稳定，与所有测试基质兼容，适合作为标准参考菌株。该研究首次提出了标准化、数据驱动的成像PAM-F定量方法，显著提高了实验可重复性和跨数据集可比性，为建筑材料生物可接受性的定量评估和跨实验室比较奠定了基础。
主要关键技术方法
该研究采用了以下关键技术方法：成像脉冲振幅调制荧光法（Imaging PAM-F）用于获取叶绿素荧光信号；系统化软件设置组合（测量光强度ML与增益G）的实验设计；基于Python编写的可定制数据评估算法（采用滑动窗口加权线性回归、过滤和评分机制）来自动选择最优设置并构建校准曲线；接触角测定了基质润湿性；分光光度法测定了L*a*b*颜色和反射率；气体比重瓶法测定了矿物颗粒的孔隙率；pH电极测定了材料与水接触后的pH值。样本包括聚碳酸酯膜（孔径0.2 μm）、白色卡拉拉大理石颗粒和CEM I混凝土颗粒（水灰比0.6，CEN标准砂），颗粒制备遵循Tonon等（2021）的方法。藻细胞密度通过Thoma计数池手动计数确定。
研究结果
3.1 材料性质
聚碳酸酯膜、混凝土颗粒和大理石颗粒表现出明显不同的性质。在400–500 nm波长范围内，大理石颗粒反射率最高（32.4% ± 0.2%），混凝土颗粒最低（16.1% ± 0.4%），聚碳酸酯膜居中（21.1% ± 0.6%）。大理石颗粒的L*值最高（63.6），混凝土颗粒最低（48.6）。聚碳酸酯膜表现出可测量的水接触角（97.5° ± 2.2°），而两种矿物颗粒均无法测量。矿物颗粒的孔隙率相近（混凝土7.5%，大理石7.8%），聚碳酸酯膜孔径为0.2 μm。24小时后pH值分别为：聚碳酸酯膜6.6，混凝土7.9，大理石7.4。
3.2 藻类活力评估
通过8小时内的F0信号强度和Fv/Fm信号面积监测，确认了Jaagichlorella sp.与所有基质的兼容性。F0信号强度在两种接种浓度下均保持稳定，但混凝土和大理石颗粒上的测量变异性较大。Fv/Fm信号面积在整个测量期间保持恒定。Fv/Fm信号强度在测量最初1.5小时内出现上升，随后趋于稳定，可能归因于接种过程引起的水分胁迫。
3.3 算法逻辑
开发的算法包含严格的评估步骤：首先对每个重复样品的F0信号进行过滤，剔除低于信号增加阈值（设定为前一个值的5%）的无效数据点以及超出检测范围的数据；然后合并四个重复样品中均有效的浓度点；采用滑动窗口线性回归（最小数据点nmin=4，最大nmax=9），通过拟合优度R2（最低0.8）和残差r（最大20%）进行过滤；最后通过评分方程结合归一化R2、归一化数据点数和平均绝对残差（权重参数a和b均为0.5）选出最优线性回归和对应软件测量设置。
3.4 软件测量设置选择与线性回归
算法为不同基质和浓度范围自动选择了不同的ML和G设置。ML始终在0–1之间，G在1–10之间。所有校准曲线的R2均高于0.986，最低值出现在大理石颗粒的高浓度范围。视觉数据与算法输出一致：接种区域呈现同心圆状信号分层，中心信号最强。大理石颗粒在低浓度时显示较高的F0信号，但高浓度时出现明显的信号过饱和，在Fv/Fm视图中表现为黑色中心区域。仅凭视觉评估难以发现最高浓度点的测量错误，而算法能正确识别。
3.5 Jaagichlorella sp.在不同基质上的校准曲线
在三种基质上均成功建立了校准曲线。聚碳酸酯膜的低和高浓度范围在10^6至10^6.5 cells/ml之间重叠，可构建从10^5.5到10^7 cells/ml的连续曲线。大理石颗粒在10^6 cells/ml处重叠，也可构建连续曲线。混凝土颗粒则在整个重叠区域完全重合，校准曲线覆盖10^6至10^7 cells/ml。总体趋势上，大理石颗粒在相同浓度下表现出更高的绝对F0信号，且在高浓度区出现过饱和后信号不形成平台反而下降，这归因于内滤效应（inner filter effect）导致的信号低估。不同基质的校准曲线斜率不同，取决于软件测量设置和材料属性。
讨论与结论
讨论部分强调：成像PAM-F设备的软件参数调节往往依赖试错，缺乏标准化导致可重复性差。本研究的算法通过数据驱动方式解决了这一问题，提供了可高度定制的过滤和评分参数，适用于不同实验设计。视觉评估虽然是重要补充，但仅凭视觉判断可能遗漏过饱和错误——例如大理石高浓度点的F0视图看似正常，而Fv/Fm视图揭示了信号错误。线性相关性在高细胞密度时因细胞层叠遮蔽效应而丧失，但这不影响针对早期定殖阶段的研究。Jaagichlorella sp.被确认为可靠的参考菌株，其F0和Fv/Fm信号在长时间测量中保持稳定，且对6.6–7.9的pH范围具有耐受性。基质反射率对信号强度影响显著：浅色高反射的大理石最易过饱和，深色低反射的混凝土最易欠饱和。孔隙率和润湿性也影响藻液滴的铺展和信号分布，但未观察到与孔隙率的直接关系。研究结论指出：所提出的标准化成像PAM-F方法首次实现了跨材料的定量生物可接受性评估；校准曲线具有基质特异性，不可在不同材料间直接转移；Jaagichlorella sp.可作为建筑生物可接受性测试的生态相关标准生物；该框架提高了实验室间可比性，为长期生物可接受性研究中生物膜发展的动态监测提供了可能。该研究发表在《International Biodeterioration》。
