《International Dairy Journal》：Proteomic and microRNA Profiling of Bovine Milk Extracellular Vesicles from Holstein Dairy Cows Fed Olive Oil Pomace
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摘要采用透射电子显微镜、Western blot、蛋白质组学分析和小RNA测序，对来自对照组（CON）和橄榄渣（OP）饲喂组奶牛的细胞外囊泡进行了表征。通过功能富集分析和靶标预测分析，鉴定了可能与EV相关蛋白和microRNA调控相关的生物学通路。在Caco-2肠上皮细胞中进
摘要
采用透射电子显微镜、Western blot、蛋白质组学分析和小RNA测序，对来自对照组（CON）和橄榄渣（OP）饲喂组奶牛的细胞外囊泡进行了表征。通过功能富集分析和靶标预测分析，鉴定了可能与EV相关蛋白和microRNA调控相关的生物学通路。在Caco-2肠上皮细胞中进一步评估了其生物活性。蛋白质组学分析鉴定出238种独特蛋白，其中近半数仅在OP来源的EV中检出，表明囊泡蛋白组发生了显著重塑。Western blot分析显示，OP来源EV中CD9和TSG101表达降低，同时HSP70含量增加，提示EV生物发生过程发生改变。小RNA测序鉴定出超过180种成熟microRNA，其中大多数在两组间共有。尽管仅有少数高丰度miRNA差异表达，但靶标预测分析一致性地突出了与神经发育、胞内运输、膜组织和脂质代谢相关的通路。网络分析鉴定出关键的脂质代谢相关靶基因，包括ACSL3、LPCAT3、NR1H2、NR1H4、APOA2和LDLR。在Caco-2细胞中，慢性暴露于乳源性EV可调节脂质相关基因的表达并改变细胞内中性脂质积累。
引言
牛奶是一种支持出生后生长的理想食品，因其含有相对较高水分以及大量的糖类、脂质、蛋白质以及各种维生素和矿物质（Haug等，2007）。在所有类型的牛奶中，牛奶是最常被饮用的，由于其庞大的牛群数量，牛奶在全球牛奶生产中占据主导地位。牛乳的产量和质量可受多种因素影响，包括气候突变、水源可用性、高温、营养充足性和饲养策略（Roufou等，2025）。不当的饮食可导致产奶量下降、奶牛健康和牛奶质量恶化，并给乳制品生产者带来重大经济损失（Erickson & Kalscheur，2020）。解决这些问题的一个可能方案是在标准牧草中补充浓缩成分，以提供营养物质和生物活性化合物，这些化合物可积极影响奶牛的健康而不损害牛奶或乳制品的质量。橄榄渣已被提议作为这一用途的潜在资源，原因如下（Vasta等，2008）。首先，作为橄榄油提取副产品的OP含有碾碎的果核、果皮和果肉，以及不可忽略的残余橄榄油，因此它是纤维、蛋白质和脂肪酸的来源。其次，这一策略将一种成本高且污染严重的废弃生物质转化为一种有价值的资源，有助于降低与动物饲料相关的成本。最后，迄今为止的研究表明，在标准牛饲料中补充OP可提高牛奶和乳制品的营养和营养保健品特性（Castellani等，2017；Neofytou等，2020）。因此，使用橄榄渣作为功能性成分来增强牛饲料似乎是一个出色的解决方案，因为它一方面显著降低了处理成本，另一方面用多酚类纤维和必需脂肪酸等生物活性化合物[14]丰富了奶牛饲料，这些化合物可积极影响动物健康。因此，这一策略不仅改善了奶牛的福利，而且作为循环经济的 compelling 典范（Scicutella等，2023）。
尽管迄今为止的研究提供了有价值的见解，但目前尚无关于OP对牛乳其他重要成分（如EV（即外泌体和微囊泡）和microRNA）可能影响的任何数据。
细胞外囊泡可作为货物结构，能够向宿主真核细胞递送蛋白、激素和白细胞介素受体、参与免疫反应的蛋白以及microRNA等调控分子（García-Martínez等，2022）。这些发现共同表明，乳源性EV在将生物活性物质运输给新生犊牛、促进免疫系统发育和肠道健康方面发挥关键作用（García-Martínez等，2022；Pluchino & Smith，2019；Reinhardt等，2012）。然而，迄今为止尚不清楚OP补充是否会改变微囊泡的产生或所运输microRNA的谱。本研究的主要目标是弥补这一知识空白。为此，从四十头多胎意大利弗里斯兰奶牛中采集了牛奶样本。动物先前被分为两组，每组分别用商业饲料（CON）或实验饲料（在CON饲料中OP部分替代玉米青贮）饲喂四周。试验开始四周后，从每头动物中采集牛奶样本并进行分析，以评估微囊泡含量、蛋白质组学图谱并鉴定所递送的microRNA。我们发现OP补充会改变乳微囊泡的蛋白质组和microRNA谱。生物信息学分析显示，差异表达的microRNA影响真核细胞中的脂质代谢，促进脂质积累。总之，这些结果证实OP补充不会损害牛乳的质量或营养特性，表明这是一种为奶牛生产强化饲料的合适策略。
章节片段
实验设计与营养概况
本研究使用的动物和实验设计与Scicutella F.等（Scicutella等，2023）描述的相同。简要地说，选择了40头在年龄、泌乳天数和产奶量方面具有同质性的奶牛，并转移至比萨大学"Enrico Avanzi"实验中心。到达后，立即对奶牛饲喂商业饲料进行为期两周的初始适应期。此后，将它们随机分为两组
乳EV的分离与表征
为了获得足够的乳源性细胞外囊泡，将饲喂标准饲料和饲喂富含橄榄渣饲料的奶牛样本均按照材料和方法部分描述的基于差速超速离心的纯化方案进行处理，并在图1中进行了说明。在120,000×g离心后，收集富含EV的沉淀。
为了确定所分离囊泡的平均直径和浓度，对CON和OP样本
讨论
牛奶是世界上商业化程度最高和需求最大的食品之一。它富含碳水化合物、蛋白质、脂肪酸、微量元素和维生素（Haug等，2007）。使牛奶成为一种独特食品的因素之一是其高含量的EV（Khanam等，2023）。体外和体内研究均表明，乳微囊泡可作为货物系统，能够向人体细胞转运蛋白质、酶、脂质和多核苷酸（如microRNA）（Sadri等，2020）。
结论
近年来进行的若干独立研究已证实，在泌乳期奶牛的饮食中富集橄榄油渣是提高乳制品质量的有效策略，同时也能解决橄榄压榨后产生的橄榄渣处理问题。本手稿报告的数据证实，OP补充会改变乳微囊泡的蛋白质组成和microRNA货物数量。特别是我们发现，OP补充
CRediT作者贡献声明
Matteo Ramazzotti：撰写——初稿、软件、方法学、形式分析。Massimo Genovese：可视化、方法学。Arianna Buccioni：撰写——审阅与编辑。Carlo Viti：撰写——审阅与编辑。Federica Scicutella：可视化、方法学、调查研究。Federica Mannelli：撰写——初稿、方法学、调查研究、形式分析、数据管理。Costanza Cicchi：撰写——初稿、方法学、调查研究、形式分析、数据管理。Simone
伦理声明
本研究按照以下动物福利和/或报告指南进行：意大利实验动物福利法指南（意大利立法令第26/2014号，转化EU指令2010/63/EU）。本研究经比萨大学伦理委员会批准。（批准编号：6/2020）
资金资助
本研究由MIPAAFT，意大利政府资助：旨在支持乳品行业投资项目研究的拨款（Mipaaft）2018年9月25日部长令第27443号。"使用特级初榨橄榄油渣进行精准饲养：调节奶牛代谢以开发新型营养乳品。缩写：EVOLAT"（DG DISR—DISR 04—Prot. Uscita
利益冲突声明
手稿"饲喂橄榄油渣的黑花奶牛乳细胞外囊泡的蛋白质组学和miRNA谱"的作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所述工作的发表。
Costanza Cicchi|Simone Luti|Lorenzo Casbarra|Leandro Di Gloria|Rebecca Sodano|Tania Gamberi|Matteo Ramazzotti|Massimo Genovese|Arianna Buccioni|Carlo Viti|Federica Scicutella|Federica Mannelli|Rosamaria Militello|Luigia Pazzagli|Paolo Paoli
