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我们的基因组包含用于产生蛋白质构建模块的遗传文本，以及第二层与DNA相互作用的信息层，提供文本应在何处及何时被读取的信息。第二层由转录因子（Transcription Factors, TFs）、组蛋白修饰和DNA甲基化介导。虽然所有注释都能影响转录，但唯一能
我们的基因组包含用于产生蛋白质构建模块的遗传文本，以及第二层与DNA相互作用的信息层，提供文本应在何处及何时被读取的信息。第二层由转录因子（Transcription Factors, TFs）、组蛋白修饰和DNA甲基化介导。虽然所有注释都能影响转录，但唯一能提供细胞类型稳定性的注释是DNA甲基化，其以两个特征著称。与其他涉及与DNA进行不稳定静电相互作用的修饰不同，甲基化涉及将甲基基团共价添加到胞嘧啶上，形成高度稳定的表观遗传标记。其次，DNA甲基化在其通过细胞分裂进行忠实维持方面是独一无二的。在这篇综述中，研究人员强调DNA甲基化是细胞命运和身份的关键调节因子。
DNA甲基化提供长期细胞类型记忆
早期组织培养实验表明，DNA上甲基基团的单纯存在对染色质结构有强烈影响，使其对DNase I消化产生抗性，这种方式完全独立于序列内容。同样，体内研究表明，DNA甲基化通过不同的分子机制（包括组蛋白修饰和高阶结构变化）限制周围核质因子的局部可及性来发挥作用。
这一重要概念在正常发育和组织适应过程中得到证实，通过高通量测序的转座酶可及染色质测定法（ATAC-seq）显示，基因组调控元件（Regulatory Elements, REs）在大多数细胞类型中处于不可及构象，但在DNA去甲基化后变得可及。当通过十-十一易位酶（Ten-eleven Translocation, TET）耗竭阻止去甲基化时，这些位点保持封闭构象，蛋白质无法再结合这些元件内的特定基序。与此一致，删除DNA甲基化机器会过度激活重复性逆转录转座子，启动转座子和基因体内的隐秘启动子转录，并产生异位蛋白结合位点。
值得注意的是，累积证据表明，将DNA甲基化视为简单的抑制性标记是一种过度简化。例如，尽管DNA甲基化限制了多种蛋白因子的结合，但特定组的转录因子（Transcription Factors, TFs）要么对DNA甲基化不敏感，要么优先结合甲基化的CpG位点。这些包括研究充分的甲基-CpG结合域蛋白以及其他几种因子。此外，研究表明，即使在甲基基团擦除之前，甲基化的REs也能通过体外细胞命运转变获得可及性。总之，这些结果表明，虽然DNA甲基化位于基因调控网络的核心，但其生物学功能仍存争议。
在此，研究人员回顾了支持DNA甲基化在发育、适应和细胞命运转变过程中稳定转录程序的主要作用的累积证据。整个系统基于由增强子和沉默子组成的基因REs的使用。这些序列的甲基化状态由遗传文本中的信息编程，该文本提供能够招募从头甲基化或去甲基化机器的基序，以及一个细胞和分化特异性的反式作用TFs系统。了解该系统将极大地提升研究人员设计和生产用于细胞替代疗法的细胞的能力。
基因调控的一般原理
简单生物体通过阻遏物和激活物系统控制基因表达，这些因子可与基因启动子相互作用并通过主要影响转录起始来影响表达程度。在高等生物中，调控复杂得多，每个组织都有许多失活基因和一些活性基因，且每个组织中基因集都不同。这需要一种新的控制模式，因为先前的模式需要过多的TFs。这是通过一个庞大的REs网络实现的。
在这个精密系统中，启动子被基础TFs激活，但随后可通过一系列远端元件进行调节，这些元件能够在三维空间中相互作用以影响转录，无论是通过激活还是抑制。每个元件本质上都是无特征的，拥有多个结合因子的基序，其中大部分不一定是细胞类型特异性的，而是普遍表达的，因此可能潜在地影响身体每个细胞中的基因表达。此外，每个元件结合多个TFs会增加启动子上方的局部TF浓度，从而化学放大其对转录的影响。
DNA甲基化作为细胞身份的标记
尽管这些REs是DNA文本本身的一部分，因此存在于身体的所有细胞中，但它们实际上以组织和发育特异性方式将反式作用TFs结合到其基序上。因此，例如，白蛋白基因周围的REs只能在肝脏中被结合，而不能在任何其他组织中被结合。相反，珠蛋白基因周围的元件只对血细胞开放以供结合，而不在肝脏或任何其他细胞类型中。网络水平分析强烈表明，这种细胞类型特异性主要由DNA甲基化编程控制。这是通过生物信息学比较小鼠多种细胞类型中组织特异性去甲基化片段和TF结合数据（DNA元件百科全书，ENCODE）确定的。对于任何给定的TF，仅在组织特异性低甲基化位点内观察到结合，而在其他组织中这些精确位点上则没有，因为这些位点的DNA是甲基化的。这幅图景也与表明大多数已知TFs是非特异性的数据一致，并且这些TFs在组织特异性基因表达中起主导作用。虽然一些TFs可以进入并结合甲基化DNA，但这种表观遗传标志通常通过提高RE激活所需的阈值来创造限制性环境。在生理TF水平下，该阈值很少达到，从而限制了不适当的激活。当需要稳定重新激活时，细胞可以增加先驱转录因子水平以结合甲基化元件并招募DNA去甲基化机器。
发育过程中组织特异性甲基化模式的产生
发育过程中如何形成组织特异性甲基化模式？几乎所有REs从着床时期开始变得甲基化，并在胚层形成期间保持此基线水平。然后，在胚胎中期（约E15-16），当谱系分化达到峰值时，区域特异性形态发生素与局部细胞相互作用并诱导特定的TFs，这些TFs可以与REs内的基序相互作用。这些结合的复合物随后充当锚点以招募去甲基化机器，后者可以主动移除该元件附近的甲基基团。一旦去甲基化，这些区域仍然可及，因为细胞核中存在的任何从头甲基化酶的局部浓度太低而无法重新甲基化这些位点，并且因为没有预先编程的序列指令来招募从头甲基化酶。应注意，虽然去甲基化本身是高度特异性的（由于局部形态发生素），但结合REs的大多数反式作用因子在许多组织中普遍表达。这种安排促进了多个TFs在高浓度下的积累，从而增加了它们在化学上与启动子相互作用时激活转录的可能性。
调控元件组织
REs在控制基因表达方面提供了很大的灵活性。如上所述，这些元件可以位于基因启动子的5'或3'端，甚至内含子内，并且可能距离基因很远，同时仍位于相同的拓扑关联结构域内。基因与多个不同的REs相关联并不罕见，其中一些在组织发育过程中打开，另一些则被编程为作为对循环因子的适应性反应而去甲基化。其他REs被设计为通过特异性招募DNA甲基转移酶而变得不可及，从而防止附近基因被重新激活。最后，应注意该系统是完全模块化的：某些特定元件可能位于多个基因结构域中，而某些基因区域可能与覆盖广泛不同特异性的调控序列相关联。
DNA甲基化在发育动态中的作用
许多研究表明，启动子和其他REs上甲基基团的存在会降低染色质可及性，从而抑制与TFs的相互作用。相比之下，只有少数研究探讨了DNA甲基化在发育中的作用。一个很好的例子是在着床时期多能性基因如Oct4和Nanog的失活。使用胚胎干细胞（ESCs）的体外研究和体内研究都清楚地表明这是一个多步骤过程。首先，一个阻遏蛋白结合到基因的REs上，从而停止转录。第二步，组蛋白甲基化酶（G9a）结合并导致基因异染色质化。只有在这一切发生后，G9a蛋白上的一个特定结构域才用于招募DNA甲基化酶，然后这些酶带来该区域的从头甲基化。因此，并不是DNA甲基化的添加使这些基因失活，而是特定的发育调控因子识别这些基因并阻止转录。尽管如此，正是DNA甲基化的持续存在阻止了这些基因再次被激活。这与通过蛋白质-DNA相互作用（例如阻遏物或异染色质）的调控形成对比，后者只是瞬时与基因结合，并且在发育后期通常不再存在。
同样的原则也定义了DNA去甲基化在发育过程中的作用。在这种情况下，指定在特定组织中激活的基因首先被高浓度的细胞类型特异性先驱因子识别并结合，引起转录激活并诱导染色质开放，从而使这些基因对DNA去甲基化机器可及。一旦这些区域经历了活跃的去甲基化，它们将在整个生命周期中保持这种状态，即使初始的先驱因子已被稀释。这些机制动力学已通过条件性敲除去甲基化所需的TET酶进行了遗传学确认，从而证明，如果没有去除甲基基团，这些组织特异性基因会迅速恢复到封闭构象。因此，看起来虽然DNA甲基化改变并不实际驱动发育，但最终的甲基化模式定义了稳定的长期细胞身份。
出生后适应
支配发育过程中DNA甲基化编程的相同原则也使得出生后发生的各种适应性变化成为可能。然而，产前细胞命运由局部形态发生素决定，而产后决策则由激素决定。一个例子是性别特异性表达模式的选择。在这种情况下，雄性和雌性出生时在多种不同组织中具有相同的表达模式，但随着性成熟，雄性会发生额外的DNA甲基化变化。这些变化显然是由睾酮分泌介导的，睾酮作为血液传播的诱导剂作用于靶细胞内的特定因子，这些因子结合指定的基序并招募DNA甲基化机器，从而导致新REs的激活。这些新模式随后在生物体的整个生命中得以维持。性别相关适应的另一个例子已在怀孕导致的乳腺中以及在响应感染的树突状细胞中观察到。
产后适应的其他例子包括肝脏对饮食变化的固有反应，例如出生后立即开始哺乳时向富含脂质的乳汁的转变。断奶后三周，表达还会发生额外改变。在后一种情况下，诱导去甲基化的细胞外信号似乎依赖于血液胰岛素浓度。此外，特定模板被设计为响应生理和环境变化而发生差异甲基化，涵盖多种事件，如慢性炎症、组织损伤，或作为正常稳态和衰老的一部分。
有证据表明，至少部分环境适应性DNA甲基化变化是为了提供一种表观遗传记忆，这种记忆深刻增强了组织对类似刺激的反应并提高了组织适应性。例如，急性炎症触发表皮干细胞中特定DNA区域的去甲基化和开放，这些变化在炎症后至少保存一年。肌肉损伤也是如此。
体细胞重编程与转分化
山中伸弥和Takahashi发现强制表达四个基因Oct4、Sox2、Klf4和Myc（OSKM）足以将体细胞转化为多能干细胞[诱导多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs）]，这从根本上改变了我们对如何实现新细胞状态以及TFs如何调控细胞身份的理解。在这一突破的基础上，大量研究已经确定了能够以不同效率和品质产生iPSCs的替代因子组合。
DNA甲基化变化对重编程不可或缺
有趣的是，从这些及相关研究中得出的一个核心见解是，DNA去甲基化对于体细胞重编程是不可或缺的。例如，Hu等人证明TET三重敲除的小鼠胚胎成纤维细胞由于无法经历早期的间充质-上皮转化而无法重编程。与此一致，TET1被证明可以在功能上替代OCT4，或者在与OCT4配对时替换SOX2和KLF4，强调了DNA甲基化重塑是成功重编程的关键决定因素。与这些发现一致，单细胞追踪研究揭示，关键REs处DNA去甲基化的程度准确预测了哪些细胞将成功完成重编程。
然而，鉴于主多能性调控因子Oct4的启动子和增强子元件在胚胎干细胞（ESCs）中以及整个发育过程中通常是未甲基化的，这些观察提出了一个重要问题：TET蛋白在重编程中的作用是否主要反映其DNA去甲基化活性，还是TETs也发挥不依赖于甲基化的功能，从而促进细胞命运转换？
重编程因子重置甲基化组的能力对于充分发挥发育潜能至关重要。适当的甲基化组重建使重编程后的细胞能够遵循正常的发育轨迹并分化为任何谱系，这定义了它们替换或模拟内源性细胞的质量和能力。支持这一观点的是，异常的印记或Dlk1-Dio3印记基因座的沉默与较差的嵌合贡献和无法生成‘全iPSC’小鼠相关。一致地，仅使用OCT4和TET1生成的iPSCs显示出比传统OSKM衍生的iPSCs显著改善的4N能力。
滋养层干细胞重编程
有趣的是，在将人和小鼠成纤维细胞转化为滋养层干细胞（Trophoblast Stem Cells, TSCs）的过程中，也观察到获得DNA甲基化组近乎完全的表观遗传重编程的相同能力。与iPSCs类似，诱导型滋养层干细胞代表了囊胚来源的TSCs的稳定、高度功能和忠实的对应物。这种卓越保真度的核心在于早期胚胎先驱因子准确再生95-99%内源性DNA甲基化景观的能力。
直接重编程（转分化）
另一种生成特定细胞身份的策略是转分化，即一个谱系直接转化为另一个谱系，而不经过一个较少分化或多能状态。经典例子包括通过强制表达MyoD将成纤维细胞转化为肌母样细胞，使用Brn2、Ascl1和Myt1l（BAM因子）将成纤维细胞转化为神经元样细胞，将成纤维细胞转化为肝细胞样细胞，以及将成纤维细胞转化为心肌细胞样细胞。尽管转分化后的细胞通常在形态上与其内源性对应物相似，并共享显著的转录相似性，但它们通常仍不稳定且依赖于持续的转基因表达，这凸显了在转分化过程中并未实现完全的表观遗传重编程。Stanger、Cedar和Buganim实验室最近的一项研究检查了多个转分化系统中的DNA甲基化，并证明这种不完全的细胞命运转变至少部分是由于未能重现原始的DNA甲基化景观。
与重编程的iPSCs不同，转分化后的细胞保留了大量的表观遗传记忆，并且未能在关键的组织特异性调控区域获得适当的DNA甲基化景观。这一发现强化了早期的工作，表明直接转化的细胞未能充分沉默起始群体的谱系程序。类似于体细胞的体外转分化，通过Oct4下调或Cdx2过表达试图将ESCs直接转化为TSC样细胞未能完全重现真正TSCs的甲基化组，从而限制了关键滋养层特异性基因如Elf5和Hand1的稳定表达。总之，这些观察结果强调，尽管在没有完全甲基化组重塑的情况下可以在很大程度上诱导形态学和转录变化，但主要在组织特异性差异甲基化区域进行的适当DNA甲基化重编程，对于建立和维持长期细胞身份至关重要。
在体内转分化的某些例子中也观察到类似的模式。例如，在损伤后肝细胞向胆管细胞的转化过程中，细胞获得了新的身份，而没有广泛地去甲基化胆管细胞特异性的未甲基化REs。然而，在另一个报道的转分化案例中，缺血性损伤后星形胶质细胞向神经干细胞（Neural Stem Cells, NSCs）的转变确实涉及NSC特异性REs处的活跃DNA甲基化重塑。这些对比鲜明的例子提出了可能性，即某些成体TFs可能起到类似先驱调节因子的作用，能够介导DNA甲基化重编程。支持这一观点，一项检查BAM因子在成纤维细胞向神经元转化过程中DNA甲基化的研究报告称，单独的Ascl1在其结合位点诱导强烈的去甲基化，这些位点富含REs，但加入Brn2显著降低了这种去甲基化活性。这些发现表明，用替代因子替换Brn2可能能够实现更完全的甲基化组重塑，并促进生成更真实的神经元。
组织特异性REs的去甲基化是否需要胚胎或干细胞状态尚不清楚。Hochedlinger小组的一项研究调查了两种MyoD驱动的转分化途径——直接转化为肌细胞与转化为肌源性祖细胞（添加forskolin、RepSox和CHIR99021；FRC）——表明广泛且必要的DNA去甲基化仅发生在后一过程中。然而，也可能是FRC混合物的添加引起了该DNA去甲基化所需先驱因子的表达，而不是这种去甲基化需要那种特定的细胞状态。
总而言之，基于目前的重编程和转分化模型，看来早期胚胎和一些干细胞TF网络携带强大（且可能是独特的）表观遗传重塑能力，而这些能力在成体细胞TF网络中基本缺失，或至少尚未被发现。
沃丁顿模型
我们从多能性到组织特化的发育途径的整体概念在很大程度上由沃丁顿的提议塑造，该提议将其可视化为一个单向过程。根据这一思想，发育沿着倾斜地形上的预定山谷“被动”进行，内置的屏障使得难以逆转方向或从一个谱系流跳跃到另一个谱系。有人提出，这些限制可能在分子水平上通过表观遗传编程介导。从某种意义上说，我们所理解的DNA甲基化动力学确实可以解释该模型的基本特征，因为这个系统使得以稳定、固定的方式定义调控区域对驱动发育的众多相互作用蛋白因子的可及性成为可能——从而设定了允许性的规则。因此，例如，处于发育特定阶段的细胞不能去分化到更早的阶段，仅仅是因为没有内置的程序来逆转甲基化变化。与这一原则表面矛盾的是，最近发现部分肝切除术后肝脏的再生是通过首先将剩余细胞恢复到更早的发育阶段来完成的。然而，对该系统的仔细分析表明，这些细胞确实被编程为具有在肝损伤后逆转其甲基化状态的能力。同样的想法也可能解释肌肉修复中发生的情况。
结论与展望
正如本综述所概述的，DNA甲基化的特殊化学特性，加上模块化RE网络的存在，使得高等生物能够以可靠且长期稳定的方式进行发育和分化。通过理解用于操作该系统的遗传编程规则并为该领域的关键问题提供答案，那么就有可能人工控制这一过程，并以这种方式实现稳定的细胞类型重编程和组织再生。
