综述：谱系追踪解析肿瘤演化与免疫微环境

《Trends Open》：Lineage tracing for deciphering tumor evolution and immune microenvironment

　　

谱系追踪（lineage tracing）越来越多地被用于在单细胞分辨率（single-cell resolution）下研究肿瘤起始、演化以及肿瘤-免疫相互作用。不同于以技术为中心的综述，研究人员聚焦于谱系解析证据如何改变我们对肿瘤起始、克隆演化、细胞状态可塑性、转移、治疗适应和免疫重塑的解读。研究人员总结了主要的单细胞谱系追踪方法和分析框架，并回顾了它们在恶性细胞以及髓系和基质谱系中的应用，特别强调了T细胞受体（TCR）定义的T细胞命运，同时概述了可用于B细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）和中性粒细胞的更有限的谱系证据。研究人员还考察了肿瘤-免疫双向选择，并解释了谱系数据如何将观察到的命运关系与提出的状态转变区分开来。

Reconstructing tumor evolution and immune cell fate
肿瘤进展是一个动态过程，恶性细胞持续多样化、在细胞状态间转换、与肿瘤微环境（TME）相互作用并适应治疗压力。传统单细胞谱分析所捕获的通常是静态快照，而谱系追踪将细胞当前状态与其克隆历史相连接，结合免疫受体谱分析和单细胞或空间方法，可揭示哪些克隆发生扩增、所在位置以及采用的状态，为肿瘤和微环境描述增添时间和祖先维度。

Box 1 Lineage-tree analytics in tumors
谱系树分析提供了将祖先、细胞状态和演化行为联系起来的定量框架。其一，通过比较分支后代细胞数是否超过中性进化模型预期，可区分中性克隆漂移与正选择。其二，适合度模型利用谱系树的拓扑结构和精细尺度估算单个细胞或亚克隆的相对生长优势。其三，通过统计转录状态沿重建肿瘤系统发育树的改变频率来量化谱系相关可塑性，高有效可塑性表示同一谱系内相近细胞反复分化至不同转录状态，低有效可塑性表示稳定趋向于某一主导状态。其四，进化耦合测量成对转录状态之间的系统发育邻近性，强耦合提示两状态常出现在相近分支或反复出现的进化路线上。其五，系统发育时间（phylotime）利用谱系树信息估算细胞与推断祖先或祖细胞样状态之间的进化距离，不同于仅基于转录相似性的伪时间，phylotime整合克隆祖先和突变衍生距离。

Principles and evolution of single-cell lineage-tracing models
From classical fate mapping to heritable lineage histories
早期谱系追踪使用脉冲追踪、移植、荧光染料、酶标记和直接观察；遗传命运图谱随后采用诱导型CreERT2（他莫昔芬诱导型Cre重组酶）或Cre-loxP系统永久标记特定细胞及其后代。这些方法奠定了命运图谱基本原理，但存在标签稀释、标记物特异性差、重组变异和移植影响等问题。现代单细胞谱系追踪（SCLT）将可遗传标签与转录组、表观基因组、空间或形态学单细胞读出整合。单细胞转录组推断的轨迹基于分子相似性，不应与谱系混淆；轨迹推断描述群体水平状态动态，而谱系追踪基于可遗传标记、条形码或突变重建祖先关系。回顾性谱系重建利用核单核苷酸变异（SNVs）、插入缺失、拷贝数改变（CNAs）、结构变异、线粒体DNA（mtDNA）突变和DNA甲基化变化等内源标记；前瞻性谱系追踪则在目标过程之前或期间引入可遗传或可编辑标签。

From lineage signals to clonal reconstruction
克隆重建首先记录每个细胞中的谱系标记，构成细胞×特征矩阵，并过滤低质量细胞和位点。共享信息性标记的细胞可归为克隆，建树方法通过序列相似性、距离、最大简约法或概率模型连接采样细胞与推断祖先及根节点。每种方法都对编辑错误率和突变率有所假设；条形码丢失、碰撞、同一位点重复编辑、饱和和不完全采样会导致部分分支不确定。谱系树建成后可关联细胞状态，用于测量克隆扩增、单细胞适合度、谱系相关可塑性、进化耦合和phylotime。

From static barcodes to dynamic lineage recorders
前瞻性系统已从静态重组酶或病毒条形码发展至动态记录器。Polylox产生Cre介导的静态条形码；GESTALT、CARLIN、DARLIN及相关系统通过CRISPR–Cas9诱导的插入缺失或胞苷脱氨酶编辑累积序列变化。基于降低双链断裂（DSB）的碱基编辑和引物编辑（PE）记录器（如SMALT和PEtracer）可减少重复切割并支持空间读出。癌症应用包括异种移植模型中静态创始人条形码与进化编辑相结合，以及KP-Tracer将肿瘤起始与谱系记录偶联于基因工程肺腺癌（LUAD）模型。这些系统能区分创始人与亚克隆关系，但存在载体整合、不完整回收、条形码碰撞和丢失、编辑饱和、编辑率不均及采样偏差等限制。重复Cas9 DSB可能引发DNA损伤反应、靶序列缺失、p53依赖性选择或记录器相关适合度效应，因此应使用匹配的阴性对照和独立方法验证。

Lineage tracing beyond cancer models
在发育和生理环境中，SCLT连接细胞状态多样性与克隆起源和命运分配。胚胎发育研究利用CRISPR谱系记录实现个体水平谱系重建，显示器官可由有限早期祖细胞产生，单个克隆可贡献多个组织；后续研究表明命运决定是渐进、空间组织且受时间限制的，而非简单逐步分支过程。造血谱系追踪显示在明显转录分化之前已存在稳定命运偏倚；内源mtDNA变异显示年轻造血中克隆多样性均衡，随年龄增长出现更多克隆扩增。类器官研究显示克隆在生长、区域贡献和对扰动反应方面存在差异，而组织水平结构可通过克隆间补偿维持稳定。

Lineage tracing for decoding malignant evolution and plasticity
Tumor origins and clonal architecture
谱系追踪显示致瘤能力并非局限于固定的癌症干细胞群体，恶性细胞可随状态变化获得或丧失该能力。在肝细胞癌（HCC）中，遗传命运图谱表明成熟肝细胞可在多种实验模型中产生肿瘤，但表观细胞起源可随肝损伤类型和致癌驱动因子而变化，后期去分化可能模糊原始谱系。已建立肿瘤中，Prom1（prominin 1）-CreERT2示踪鉴定出增殖性Prom1⁺群体，该群体可产生更分化的肿瘤细胞并在进展中获得压力适应特征。单细胞DNA测序显示HCC可通过突然拷贝数变化或逐渐积累改变演化，具有持续克隆多样化的肿瘤表现出更高瘤内异质性和更差临床结局。

Neutral growth and clonal selection
SCLT将祖先与分子状态相关联，可区分中性漂移与亚克隆选择或独立起源。EVOFLUX使用波动性胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）甲基化作为回顾性条形码，显示慢性淋巴细胞白血病（CLL）以中性生长为主，而Richter转化涉及亚克隆扩增或独立克隆出现，表明临床恶性转变可能反映间歇性选择而非持续正选择。

Polyclonal initiation and clonal dominance
在Apc^Min/+小鼠中，自靶向归巢向导RNA（hgRNA）系统提示15–30%的肠道癌前病变由多个创始人细胞起始。基于降低DSB的碱基编辑DNA条形码系统进一步显示Apc驱动的病变在单克隆占据优势前可包含多个谱系，这些创始人克隆占据不同空间区域并表达互补的KRAS/分泌样或MYC/干样程序。人类腺瘤和结直肠癌（CRC）数据将单克隆性与增殖程序、KRAS突变和更具免疫抑制性的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）状态相关联。

Metastatic selection
Simeonov等人使用macsGESTALT（一种诱导型Cas9谱系记录器）结合scRNA-seq追踪转移性胰腺导管腺癌小鼠模型。原发胰腺肿瘤和转移部位的谱系重建显示连续的上皮-间充质转化（EMT）谱，高转移克隆优先占据晚期杂交EMT状态而非完全间充质状态。这些杂交程序从上皮祖先中反复出现，提示定向选择而非中性漂移。该框架还鉴定出跨克隆S100信号，提示旁分泌信号可增强转移过程中的迁移和侵袭程序。

Lineage tracing dissects therapy resistance
在CRC模型中，Whiting等人证明了两种耐药路径：SW620细胞遵循预先存在的耐药选择模型，不同重复中相似条形码反复富集；HCT116细胞遵循药物耐受持久态（DTP）介导的随机逃逸模型，敏感细胞先进入可逆持续状态，随后稀有谱系扩展为稳定耐药克隆。Rehman等人使用高复杂度慢病毒条形码在CRC患者来源异种移植中追踪克隆，发现化疗、持续和再生长状态之间条形码多样性大致保留，支持微小残留病（MRD）/DTP介导的持续模型而非稀有耐药克隆的选择。DTP被描述为治疗压力诱导的可逆、非突变状态，由微环境塑造，持续细胞采用类滞育静止程序以耐受化疗。

Lineage-associated plasticity
在LUAD中，Waddington最优输运提示肺泡2型（AT2）样细胞通过高可塑性细胞状态（HPCS）发生转变，而KP-Tracer提供前瞻性证据表明这一窗口短暂、谱系限制，随后出现选择性转移扩增。分泌型荧光素酶示踪显示Slc4a11⁺ HPCS后代可产生分化和进展状态，并能超越整体群体生长。谱系追踪可连接采样点观察到的细胞与其共享克隆历史，但多数记录系统仅在实验终点读取，短暂存在的祖先或中间状态可能已消失。

Spatial lineage tracing of tumor clone dynamics
空间谱系追踪询问哪些克隆扩增、在何处扩增以及遇到哪些状态和邻居。Spatial KP-Tracer将快速亚克隆爆发与肿瘤核心优势联系起来；PEtracer将局部增殖与推断的内在适合度区分开；SPACE-seq将CRISPR条形码与Slide-seq结合，揭示相关肿瘤克隆内的转录多样化以及肿瘤-基质双向重塑。这些方法通常在固定组织的单一时间点分析，因此显示空间关联而非直接随时间追踪克隆；不完全采样和谱系信息与空间信息匹配不精确进一步限制了解释。

Lineage-resolved TMEs
Myeloid lineage tracing
经典命运图谱（尤其Cx3cr1-Cre/CreERT2）显示多种组织驻留巨噬细胞在出生前建立并可独立于循环单核细胞自我维持；Ms4a3示踪更特异标记单核细胞祖细胞，并显示循环单核细胞对不同组织和疾病背景下组织巨噬细胞的贡献程度不同。在人类肺癌和卵巢癌中，基于mtDNA的克隆重建将TAM和3型树突状细胞（DC3s）与循环或组织浸润单核细胞联系起来，并鉴定出巨噬细胞偏向和DC偏向的单核细胞克隆。在胰腺癌中，诱导命运图谱显示招募的单核细胞先进入短暂中间态，随后产生两种长寿命终末TAM谱系。相比之下，HCC的scRNA-seq鉴定了FOLR2⁺、SPP1⁺和MT1G⁺ TAM状态，RNA速度仅提示向FOLR2⁺ TAM的可能转变；转录方向性本身无法建立发育起源或迁移关系。

Stromal lineage tracing
癌症相关成纤维细胞（CAFs）包含肌成纤维样、炎症样、抗原提呈样、血管/血管周样等功能状态。在HCC中，伪时间分析提示肌成纤维样、脂质处理、血管和抗原提呈CAF程序间的转变；SPACE-seq谱系追踪显示肝星状细胞发生局部克隆扩增，静息与活化状态共享条形码，将基质谱系转变与局部促肿瘤相互作用联系起来。直接遗传追踪提供更强证据：在CRC中，Lepr⁺谱系追踪鉴定出隐周基质细胞是增殖性ACTA2⁺ CAFs的重要来源；在黑色素瘤和胃癌模型中，诱导谱系追踪鉴定出CD34⁺PI16⁺成纤维细胞通过FOXS1依赖性转变成为ACTA2⁺肌成纤维CAFs。因此，伪时间提示转变，而命运图谱直接检验CAFs起源。

Immune lineage tracing beyond T cells
NK细胞和中性粒细胞缺乏稳定且多样的重排受体条形码，因此依赖mtDNA变异、祖细胞命运图谱、引入条形码或短期动力学示踪。B细胞受体（BCR）序列可识别相关B细胞克隆，并通过体细胞超突变和类别转换记录克隆成熟；在肾细胞癌中，空间和BCR库分析显示B细胞克隆在三级淋巴结构内多样化，随后产生浆细胞并扩散至周围肿瘤区域。但由于BCR在亲和力成熟过程中持续变化，相关B细胞通常归为克隆家族而非相同受体序列。BCR克隆扩增或成熟并不能证明肿瘤抗原特异性，仍需抗体重建或直接抗原验证。NK细胞谱系追踪因缺乏唯一重排受体而不成熟，体细胞mtDNA突变曾用于鉴定持续存在的适应性NK细胞克隆，但研究背景是病毒感染而非癌症；DNA条形码白血病模型显示持续NK细胞压力可消除敏感肿瘤克隆并选择耐药克隆，但条形码由肿瘤细胞携带而非NK细胞。中性粒细胞短寿且增殖能力有限，研究更多关注募集和状态改变而非长期克隆扩增。

TCR tracing and therapy-driven immune remodeling
TCR clonality, antigen recognition, and T-cell fate
TCR序列可作为跨细胞状态、组织和时间点的天然克隆标识符，但TCR克隆型仅识别来自同一V(D)J重排T细胞克隆的细胞，不记录连续细胞分裂，也不构建完整的亲本-子代关系，因此提供克隆水平命运图谱而非完整谱系树。同一TCR克隆型的细胞在抗原刺激后可占据不同功能状态，如干样/记忆样、PD-1⁺干样、耗竭状态等。克隆扩增本身并不证明肿瘤抗原识别，扩增克隆可能包括响应病毒、微生物或炎症抗原的旁观者T细胞，因此TCR示踪需要结合抗原验证、肽段刺激或TCR去孤儿化。TCR特异性和亲和力可影响抗原敏感性、扩增能力和耗竭易感性。跨癌种中，高度扩增的CD8⁺肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）克隆常显示组织驻留记忆、效应记忆或耗竭表型，支持干样-效应-终末耗竭轴。CXCL13在终末耗竭T细胞（Tex）中富集，但在对免疫检查点阻断（ICB）有响应的肿瘤中，CXCL13⁺肿瘤反应性T细胞可能保留功能潜力。TCF-1⁺前体耗竭CD8⁺ T细胞位于淋巴生态位，可产生进入肿瘤的效应或耗竭后代。

Immunotherapy-induced clonal remodeling
TCR示踪揭示ICB后两种模式：持续存在的肿瘤内克隆可扩增并获得GZMK–MHC-II程序，新出现的或循环抗原经历克隆也可进入肿瘤。克隆复兴与克隆替换并不互斥，其平衡取决于肿瘤类型、治疗、淋巴结构、抗原景观和采样。PD-1阻断主要扩增或激活前体样耗竭细胞和持续克隆，使其转向活化或中间耗竭状态，而预先存在的耗竭TIL通常显示有限的转录和表观遗传可塑性，可能无法在PD-1阻断后转变成非耗竭表型。不同检查点组合产生不同克隆轨迹：抗CTLA-4联合抗PD-1可扩增预先存在的记忆群体，同时保留干扰素（IFN）和耗竭程序；抗LAG-3联合抗PD-1可增加转录状态间的共享，并通过互补机制将预先存在的克隆从IFN高耗竭轨迹重定向至效应记忆或组织驻留程序。

Lineage tracing of reciprocal interactions between tumor lineages and microenvironmental lineages
谱系分辨研究显示肿瘤演化与TME变化并非独立过程。在非小细胞肺癌接受nivolumab治疗的患者中，配对治疗前/治疗中基因组分析显示携带实验验证免疫原性新抗原的肿瘤克隆被优先丢失，说明抗肿瘤免疫对不同克隆施加不同选择。在小鼠B细胞急性淋巴细胞白血病模型中，DNA条形码标记的肿瘤细胞暴露于NK细胞后，大多数肿瘤克隆被消除，但预先存在的耐药克隆和实验过程中获得耐药的克隆在NK压力下扩增，直接证明NK细胞细胞毒性可选择存活肿瘤克隆。反向影响同样存在：胰腺癌中，遗传谱系追踪显示间皮细胞可在白介素-1和转化生长因子-β信号下转化为抗原提呈CAF（apCAF），促进初始CD4⁺ T细胞向调节性T细胞转化；诱导型单核细胞命运图谱显示循环单核细胞先进入短暂中间TAM状态，随后产生两种具有不同瘤内位置和分子特征的长寿命TAM谱系。空间方法如Slide-GoTags可在同一组织切片中结合单核转录组、靶向肿瘤基因分型、TCR测序和空间坐标，用于鉴定表达新抗原的肿瘤细胞与候选同源T细胞克隆型的空间共定位。SPACE-seq在NRAS^G12V驱动的Trp53敲低肝内胆管癌中揭示单克隆肿瘤起源