《Food Bioscience》：Hemp fermentation enriches acid-resilient
Lacticaseibacillus paracasei psychobiotic candidates from water kefir while preserving neuroactive potential
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水开菲尔代表了psychobiotic候选菌株的重要来源，然而，单个菌株在抵抗胃肠道应激的同时保留神经活性生物合成潜力的能力仍知之甚少。能够将这些微生物调理至更强耐受力的方法因此可能提高其作为psychobiotic候选菌株的潜力。在本研究中，研究人员探讨了大
水开菲尔代表了psychobiotic候选菌株的重要来源，然而，单个菌株在抵抗胃肠道应激的同时保留神经活性生物合成潜力的能力仍知之甚少。能够将这些微生物调理至更强耐受力的方法因此可能提高其作为psychobiotic候选菌株的潜力。在本研究中，研究人员探讨了大麻生态位能否在保留水开菲尔来源的psychobiotic候选菌株神经活性潜力的同时，将其调理至增强的胃肠道耐受力。研究人员在浸没式（submerged）和固态（solid-state）条件下，将干燥的大麻叶和花与水开菲尔菌群进行发酵。采用多组学（multi-omics）和体外胃肠道（gastrointestinal, GI）试验研究大麻生态位适应及其对胃肠道应激耐受力（gastrointestinal stress resilience）的影响。尽管开菲尔菌群具有分类多样性，浸没式发酵优先支持了副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）的持续存在。比较基因组学显示，发酵前与发酵后分离株之间的差异有限，仅在应激相关分子伴侣clpC上存在细微变异，并富集了一个携带假定DNA加工基因的低丰度谱系。发酵后菌株表现出增强的耐酸能力和升高的trp表达，而gltB和gdh的表达则呈谱系依赖性。所有菌株均缺乏质粒和可移动的抗菌药耐药元件。总体而言，大麻作为一种调理生态位，在保留神经活性潜力和基因组安全性的同时，富集了具有耐受力的L. paracasei菌株。
抑郁症是全球致残的主要原因之一，给社会和经济带来沉重负担。现有药物和心理干预难以使所有患者获得持续缓解，且存在副作用，因此需要替代治疗策略。微生物-肠-脑轴（microbiota-gut-brain axis）的发现使肠道微生物成为精神健康干预的新靶点，能够通过该轴发挥精神健康益处的微生物被称为psychobiotics（精神益生菌）。水开菲尔富含微生物多样性，是psychobiotic候选菌株的重要来源，但部分水开菲尔来源菌株在模拟胃肠消化中存活率较低，如副干酪乳杆菌CT12在模拟胃消化中存活率为57%、肠消化中为40%，提示其内在胃肠道应激适应能力有限。工业大麻（Cannabis sativa）含有大麻素、酚类等多种生物活性成分，可影响微生物生长与代谢，可能作为调理生态位（conditioning niche）筛选出具有增强功能特征的菌株。研究人员因此提出假设：利用藏区水开菲尔菌群发酵工业大麻，可驱动适应性变化，使菌株在代谢大麻来源化合物的同时增强胃肠道耐受力，并保留神经活性潜力。该研究发表于《Food Bioscience》。
研究人员将从立陶宛农业与林业研究中心（LAMMC）采集的干燥大麻叶和花，分别以浸没式（submerged）和固态（solid-state）方式与水开菲尔菌群发酵14天；水开菲尔菌粒源自同一研究中心，由当地生产商提供。主要技术方法包括：对藏区水开菲尔菌粒进行鸟枪法宏基因组测序（shotgun metagenomic sequencing），对发酵前后分离菌株进行全基因组测序；通过SPAdes等组装与分箱流程重建宏基因组；利用比较基因组学分析直系同源基因簇；采用体外模拟胃肠应激试验测定菌株对胃酸、胃蛋白酶、胆盐/胰酶的存活率；利用实时荧光定量PCR（qPCR）检测神经活性物质合成相关基因的表达。
3.1 水开菲尔培养物的微生物组成
通过宏基因组测序和基因组分箱，研究人员获得7个高质量宏基因组组装基因组（metagenome-assembled genomes, MAGs）。分类分析显示，菌群主要由乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）和醋酸杆菌科（Acetobacteraceae）组成，前者包括Leuconostoc pseudomesenteroides、Lentilactobacillus kefiri、Lacticaseibacillus paracasei和Lactobacillus kefiranofaciens，后者包括Gluconobacter属、Acetobacter fabarum和Acetobacter persici。这反映了开菲尔中乳酸菌与醋酸菌共生的生态结构。
3.2 浸没式发酵促进副干酪乳杆菌活性
在14天发酵过程中，浸没式发酵的pH从7.61降至4.60，表明有机酸产生活跃，符合乳酸菌活动特征；固态发酵则无明显pH变化，提示产酸微生物活性有限。发酵后仅回收到的菌种为副干酪乳杆菌，且未在YGC培养基上生长，说明大麻生态位选择性地富集了L. paracasei，而不利于醋酸菌存留。
3.3 大麻生态位富集低丰度副干酪乳杆菌谱系
比较基因组学分析显示，发酵前4个L. paracasei分离株基因组完整度高、直系同源基因补体一致。发酵后获得两种基因组谱系FLA4和FLA5；FLA5保留与发酵前菌株相同的2,671个直系同源基因簇，FLA4则额外含有一个与DNA加工相关的假定基因。由于该基因也存在于公共数据库中的L. paracasei基因组中，研究提示FLA4谱系可能原本以低丰度存在于开菲尔菌群中，被大麻生态位富集，而非发酵驱动的大规模基因组重塑。
3.4 大麻发酵对天然应激相关分子伴侣的影响
对9个应激相关分子伴侣（groEL、groES、clpB、clpP、clpY、clpC、clpC1、perR和sodA）的系统发育比较显示，发酵前后菌株的对应基因高度保守，仅FLA4谱系的clpC存在一个单核苷酸替换（A→G），导致开放阅读框第35位天冬酰胺（N）变为天冬氨酸（D）。AlphaFold3预测的ClpC蛋白三维结构几乎相同，提示该替换未改变蛋白整体折叠。
3.5 大麻发酵增强副干酪乳杆菌的耐酸能力
体外模拟胃肠应激试验显示，所有菌株对胃酸、胃蛋白酶及胆盐/胰酶均表现出较高存活率。其中，发酵前菌株K4在pH 2.5处理4小时后存活率为85.83%，而发酵后菌株FLA4和FLA5的存活率分别为95.57%和98.20%，显著提高（p = 0.033和p = 0.025）。胃蛋白酶及胆盐/胰酶耐受性虽有所提高但未达到显著差异，表明大麻生态位特异性增强了与酸应激相关的耐受能力。
3.6 大麻发酵保留神经活性化合物合成的转录潜力
基因组功能注释发现，L. paracasei含有完整的色氨酸从头合成途径（trp）、谷氨酸代谢基因（gltB和gdh）及丙酮酸脱氢酶复合体基因（pdc）。qPCR结果显示，发酵后菌株的trp表达量较发酵前菌株显著升高，FLA4和FLA5分别约为K4的1.7倍和2.6倍。谷氨酸代谢相关基因表达呈谱系依赖性：FLA5的gltB表达显著升高，FLA4的gdh表达显著升高，pdc表达无显著差异。这提示大麻发酵未损害且可能增强了与神经活性物质合成相关的转录潜力。
3.7 基因组证据支持发酵后副干酪乳杆菌的安全性
抗菌药耐药基因筛查发现，发酵后L. paracasei基因组仅检出1个与季铵化合物耐受相关的染色体编码基因，未发现其与转座子关联，也未检出质粒和毒力基因。这表明该耐药决定簇水平转移可能性低，发酵后菌株保留了良好的基因组安全性特征。
讨论与结论：本研究证明，大麻生态位作为选择性生态过滤器，从水开菲尔微生物组中优先富集了具有耐受力的副干酪乳杆菌种群，包括在环境条件改变后可被检出的低丰度谱系。大麻发酵增强了菌株的耐酸能力，同时保留了神经活性化合物生物合成，尤其是从头色氨酸合成所需的基因组和转录潜力。色氨酸是血清素的前体，而血清素在情绪调节中具有核心作用，因此富集trp表达升高的菌株可能有利于psychobiotic功能。此外，发酵后菌株无质粒和可移动抗菌药耐药决定簇，符合益生菌安全性评价要求。研究结论为：大麻生态位充当选择性的生态过滤器，优先从水开菲尔微生物组中富集具有耐受力的副干酪乳杆菌种群，包括在改变的环境条件下变得可检测的低丰度谱系；接触大麻生态位增强了耐酸能力，同时保留了神经活性化合物生物合成（尤其是从头色氨酸合成）的基因组和转录潜力；发酵后菌株保留了良好的基因组安全性特征，即缺乏质粒和可移动的抗菌药耐药决定簇。这些发现凸显了大麻发酵作为一种有前景的调理和富集耐受力psychobiotic候选菌株的策略，在微生物-肠-脑轴干预中具有潜在应用价值。对水开菲尔产业而言，该策略可在不引入外源益生菌株的情况下，通过靶向底物发酵选择性地富集天然存在于复杂开菲尔菌群中的L. paracasei谱系，从而改善发酵剂的功能组成，并为标准化水开菲尔产品开发提供技术路径。未来研究可进一步利用该平台提高神经活性功能，如增加色氨酸及下游吲哚衍生物的产生。
