Ustilago esculenta 中 Gα亚基的功能解析：Uegpa3 调控 cAMP-PKA 依赖性双态性及对 Zizania latifolia 的致病性

《Fungal Biology》：Functional dissection of Gα subunits in Ustilago esculenta: Uegpa3 governs cAMP-PKA-dependent dimorphism and virulence to Zizania latifolia

　　

• 在玉米黑粉菌中鉴定出四个Gα亚基旁系同源物。
• Gα旁系同源物在玉米黑粉菌中表现出功能分歧。
• Uegpa3调控与cAMP相关的形态发生和交配。
• Uegpa3是玉米黑粉菌致病性的关键调控因子。

引言

水生蔬菜是中国特色农产品体系的重要组成部分，在保障膳食多样性和促进农业经济发展方面发挥着不可替代的作用（Chung和Tzeng, 2004）。其中，茭白是由菰（Zizania latifolia）被黑粉菌（Ustilago esculenta）寄生后形成的，因其富含膳食纤维、氨基酸和矿物质而成为餐桌上的常见食物（Yan等，2018）。作为中国"第二大水生蔬菜"，茭白支撑着长江流域和中国南方多个省份的农业经济（Zhao等，2019, 2024）。这种独特的寄主-病原共生关系不仅产生了巨大的经济价值，还作为研究真菌寄生和寄主表型调控分子机制的天然模型系统（Zhang等，2012; Zhao等，2019）。

玉米黑粉菌属于黑粉菌科，与模式真菌玉米黑粉菌（Mycosarcoma maydis，即Ustilago maydis）亲缘关系密切。两者均表现出典型的双态特性——在性激素诱导下，在酵母样细胞和侵染性双核菌丝体形态之间进行形态转换（Chung和Tzeng, 2004; Zhang等，2020）。这种转换是玉米黑粉菌寄生生命周期中的核心环节：相容的酵母样细胞识别性激素信号，通过接合管实现细胞融合，并发育为侵染性双核菌丝体，最终侵入菰，诱导茎部肿胀（Zarnack等，2008; Wahl等，2010; Zhang等，2019）。值得注意的是，在自然田间条件下，并非所有被玉米黑粉菌感染的菰都能发育成可食用的茭白。还有两种其他表型：雄茭白（不肿胀）和灰茭白（茎内充满深褐色冬孢子）（Zhang等，2014, 2017）。研究证实，这三种表型的分化直接取决于玉米黑粉菌的致病性。灰茭白的形成与真菌冬孢子的大量增殖有关，而雄茭白的出现可能与病原体侵染性的丧失或寄主抗性的激活有关（Chan和Thrower, 2010; Zhang等，2012）。因此，揭示玉米黑粉菌致病性的调控机制是解释寄主表型分化的关键。这种理解对于提高茭白质量和控制灰茭白相关病害也具有重大实践意义。

在调控真菌形态发生和致病性的分子网络中，保守的cAMP-PKA和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联途径发挥核心调控功能（García-Pedrajas等，2010; Klosterman等，2007; Nadal等，2008; Zhang等，2019）。MAPK途径感知外部信号，通过保守的连续磷酸化控制生长、发育、胁迫耐受和侵染（Thines等，2000; Zhang等，2021）。活化的MAPKKK磷酸化MAPKK，MAPKK进一步激活MAPK。磷酸化的MAPK转位进入细胞核，激活转录因子和下游基因（Hamel等，2012）。MAPK级联途径具有进化保守性，但在不同真菌中功能各异。在酿酒酵母中，Ste11-Ste7-Fus3/Kss1控制交配和菌丝生长（Good等，2009; Hohmann, 2009）。其直系同源物Ste11-Hst7-Cek1/Cek2使白念珠菌实现酵母-菌丝转换和寄主侵入（Alonso-Monge等，2006; Ramírez-Zavala等，2013）。在玉米黑粉菌中，UePrf1整合cAMP-PKA和MAPK信号，上调mfa/pra和bE/bW，将酵母细胞转化为侵染性菌丝体（Kaffarnik等，2003; Wahl等，2010; Zhang等，2018a, Zhang等，2018b）。UeKpp2和UeKpp6介导接合管和菌丝生长（Hu等，2016; Zhang等，2018a, Zhang等，2018b）。效应因子UePep1和UeRak1支持寄主穿透和菌丝极性（Liu等，2018; Huang等，2024）。这些研究表明，MAPK途径在玉米黑粉菌寄生过程中构成了一个多节点、多层级的调控网络。

然而，生物信号转导很少涉及孤立途径；MAPK途径的上游激活通常涉及与其他信号网络的复杂串扰。值得注意的是，异三聚体G蛋白信号通路是cAMP-PKA级联途径的关键上游激活因子，两条通路协同调控真菌的形态发生和致病性（Feng等，1998; Tang等，2021; Zhang等，2021）。G蛋白信号通路的核心组分包括异三聚体G蛋白（由α、β和γ亚基组成）、腺苷酸环化酶（Uac1）和蛋白激酶A（由调节亚基Ubc1和催化亚基Adr1组成）（Krüger等，2000）。信号转导依赖于Gα亚基的"分子开关"功能。当G蛋白偶联受体（GPCR）感知细胞外信号（例如性激素、营养物质）时，与Gα亚基结合的GDP被GTP交换，导致Gα亚基与Gβγ二聚体解离。解离的亚基随后激活腺苷酸环化酶等下游效应分子，从而启动进一步的信号级联（Liu和Dean, 1997; Chakravorty和Assmann, 2018; Smrcka和Fisher, 2019）。在丝状真菌中，Gα亚基具有多种特异性功能。系统发育上，它们分为三类（I类、II类、III类）。它们通过不同的下游靶标控制生理功能：I类抑制和II类刺激腺苷酸环化酶以改变细胞内cAMP水平。该途径在许多植物病原真菌中已得到保守和验证（H. Liu等，2018）。相比之下，III类Gα触发的PLCβ–IP3/DAG–钙信号级联在哺乳动物和其他非真菌真核生物中研究较为深入（Jain等，2002; Nance等，2013; Ono等，2023），但在丝状真菌中尚无实验证据验证该途径。研究表明，真菌III类Gα蛋白主要作为cAMP信号通路的正调控因子（Guo等，2016a, Guo等，2016b）。在白念珠菌中，Gα亚基Cag1p和Gpa2p调节细胞内cAMP水平，它们控制性激素触发的交配、菌落生长和寄主感染（Dignard等，2008）。在稻瘟病菌中，Gα MoMagB或腺苷酸环化酶MoMac1的缺失会阻止附着胞发育并降低毒力。MoMagA、MoMip11和MoPdeH的相互作用维持细胞内cAMP稳态（Wu等，2024; Yin等，2018）。在玉米黑粉菌中，Gpa3主导性激素信号，通过Uac1和PKA调节cAMP含量以控制菌丝生长和致病性（Regenfelder等，1997; Krüger等，1998）。在甘蔗黑粉病菌中，SsGpa3上调SsUAC1和SsADR1，提高内源性cAMP以促进交配和菌丝化。SsGPA3的缺失会降低cAMP和细胞内ROS水平，损害真菌形态发生和毒力（Chang等，2019）。综上所述，这些报告将Gα亚基定义为真菌信号转导和致病性的核心调控因子。

尽管Gα亚基在真菌中的重要性已得到充分证实，但其在玉米黑粉菌中的具体作用仍基本未知。因此，关键问题仍未得到解答：其基因组中Gα亚基因的数量和序列特征，以及不同Gα亚基在调控玉米黑粉菌双态转换和致病性中的潜在参与。解决这些问题对于弥合这一知识空白并阐明玉米黑粉菌与菰相互作用背后的分子机制至关重要。在本研究中，我们通过筛选和序列分析，最初在玉米黑粉菌基因组中鉴定出四个编码Gα亚基的基因，命名为Uegpa1–Uegpa4。结构域分析和系统发育分析确认这四个基因均具有典型的Gα蛋白结构域，并与玉米黑粉菌的Gpa1–Gpa4亚基共享高度序列同源性。在此基础上，我们初步研究了这四个基因与玉米黑粉菌双态转换和致病性的关联。本工作旨在为玉米黑粉菌调控寄生和茭白表型分化的机制提供理论见解，并为茭白产业中控制灰茭白和培育优质品种提供潜在的分子靶标。

材料与方法

培养基和培养条件

大肠杆菌DH5α菌株（Takara，日本）在Luria Bertani（LB）培养基（2%蛋白胨，1%酵母提取物，2% NaCl）中于37°C培养。一对T型性相容菌丝体菌株UeT14（a1b1，CCTCC AF 2015016）和UeT55（a2b2，CCTCC AF 2015015）分离自灰黑粉病侵染的菰（品种：龙茭2号；菌株编号：208、024）。黑粉菌U. esculenta在28°C的YEPS培养基（2%蛋白胨，1%酵母提取物，2%蔗糖）中培养。

G蛋白α亚基因鉴定

基因组

G蛋白α亚基因的克隆和表达模式

测序分析显示，Uegpa1、Uegpa2、Uegpa3和Uegpa4的开放阅读框（ORF）长度分别为1062 bp、1074 bp、1065 bp和1683 bp，分别编码353、357、354和560个氨基酸的蛋白质。这些基因均不含内含子。这四个G蛋白α亚基均具有典型的Gα结构域，包括GTP/Mg2+结合位点、GoLoco结合位点、腺苷酸环化酶相互作用位点以及βγ复合物相互作用位点（图1A）。系统发育分析

讨论

本研究在玉米黑粉菌中鉴定出四个G蛋白α亚基因（Uegpa1–Uegpa4），它们均具有保守的Gα结构域和完整的功能位点，与真菌Gα亚基的典型结构特征一致。系统发育分析表明，Uegpa1和Uegpa2与其在U. bromivora中的直系同源物聚类。Uegpa3与U. trichophora的同源基因聚为一类。Uegpa4与S. reilianum的基因具有最接近的系统发育亲缘关系。这些

结论

总之，本研究系统表征了玉米黑粉菌中的四个Gα亚基因，揭示了它们在真菌发育和致病性中的不同作用。Uegpa3被确定为致病性所必需的，通过cAMP-PKA途径调控双态转换。这一结论得到了细胞内cAMP水平实验证据和在外源cAMP补充后ΔUegpa3突变体接合管形成能力恢复的支持。相比之下，删除

贡献声明

张美梓 Peng：撰写初稿，方法论，数据管理。余金梦 Yu：验证，方法论，概念化。蔡映辉 Cai：验证，形式化分析。唐金天 Tang：指导，概念化。叶紫洪 Ye：项目管理，资金获取。邹航 Zou：撰写-审阅与编辑，概念化。张雅芬 Zhang：撰写-审阅与编辑，项目管理，资金获取。

资金

本工作由浙江省高层次人才特殊支持计划和国家自然科学基金联合基金（编号U20A2043）资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

张美梓 Peng | 余金梦 Yu | 蔡映辉 Cai | 唐金天 Tang | 叶紫洪 Ye | 邹航 Zou | 张雅芬 Zhang