一种用于神经囊虫病的改进型免疫检测方法：采用校准至岩藻糖当量的猪带绦虫诊断性囊虫糖蛋白

《Experimental Parasitology》：An improved immunoassay for Neurocysticercosis using Taenia solium diagnostic cyst glycoproteins calibrated to fucose equivalents

　　

• •
  开发了一种新颖的免疫原等效方法用于NCC血清学诊断。
• •
  糖基化被确定为糖蛋白抗原性的关键决定因素。
• •
  通过岩藻糖含量校准，提高了对不同NCC形式中抗体的检测能力。
• •
  点印迹法优于EITB，尤其在少囊型NCC中表现更优。
• •
  尽管敏感性提高，诊断特异性仍保持100%。

引言

神经囊虫病（NCC）由猪带绦虫（Taenia solium）的中间宿主动物幼虫阶段引起，是最常见的中枢神经系统蠕虫感染，也是全球获得性癫痫的主要病因之一^{1, 2}。NCC的诊断主要依赖于神经影像学检查，特别是计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI），可提供囊性病变的数量、位置、阶段和特征信息（1）。血清学检测提供补充证据，包括基于抗体的检测方法，如酶联免疫吸附测定（ELISA）和酶联免疫电转移印迹（EITB），以及靶向循环猪带绦虫抗原的抗原检测法。虽然EITB在多发存活囊肿患者中具有高度特异性和敏感性，且抗原检测法可提供活动性感染的证据，但它们在单发或少囊型患者中的敏感性显著降低（3）。尽管现有检测方法对多囊型NCC的敏感性很高（>95%），但在少囊型中的表现明显较差，敏感性降至60%以下（3）。这一诊断缺口在印度尤为相关，在印度单发囊肿约占NCC病例的三分之二，使现有血清学工具不够充分，可能导致高达40%的少囊型感染漏诊（4）。分子方法，包括PCR和更近期的宏基因组二代测序（mNGS），也已被探索用于直接检测猪带绦虫DNA和NCC的分子确认，尽管其应用仍主要限于特定的临床标本和专业环境^{5, 6}。与此同时，蛋白质组学和基于质谱的方法也已被研究用于识别寄生虫来源的蛋白质和NCC诊断的新型蛋白质生物标志物（7）。因此，尽管在影像学、血清学、分子和蛋白质组学方法方面取得了进展，少囊型NCC的可靠诊断仍然具有挑战性。

酶联免疫电转移印迹（EITB）是NCC推荐的血清学检测。它检测针对七种扁豆凝集素特异性猪带绦虫囊肿糖蛋白的抗体，分子量范围为13至50 kDa。这些糖蛋白通过扁豆凝集素亲和层析从囊肿中分离，以扁豆凝集素特异性糖蛋白混合物的形式存在。它们需要通过SDS-PAGE分离后才能用于Western印迹，以检测囊虫抗体与不同分子量糖蛋白的结合。然而，尽管这些糖蛋白的浓度和抗原特性对于优化抗体结合很重要，但在该检测中并未定义（8）。EITB中使用的特异性抗原浓度不理想，可能解释了在抗体反应较弱的情况下（如单发囊肿感染或抗体水平下降时，如钙化和恢复期神经囊虫病）检测率较低的原因（9）。

猪带绦虫囊肿富含含甘露糖的糖蛋白，支持使用甘露糖结合扁豆凝集素进行蛋白质分离（10）。这些诊断蛋白为N-糖基化蛋白，宿主体液免疫反应主要针对其碳水化合物部分^{11, 12}。N-糖链结构为复杂的、核心糖基化的，由N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖和高甘露糖分支组成，占每个糖蛋白总分子量的30–66%^{10, 13}。

为了改善EITB的诊断性能，我们纯化了七种扁豆凝集素特异性糖蛋白中的六种、其肽和糖基化N-糖链组分，并使用点印迹法对其进行定量和免疫反应性评估。血清抗体与糖蛋白及其糖链结合，而对肽组分的反应性可忽略不计。这些发现支持开发一种靶向糖基化蛋白（以岩藻糖定量）的点印迹免疫检测，以增强NCC的检测，特别是少囊型。

各节摘要

猪带绦虫诊断囊肿糖蛋白的纯化

通过扁豆凝集素-琼脂糖亲和层析纯化15毫克的猪带绦虫囊肿蛋白（3），240微克的洗脱蛋白通过制备型非还原4–20% SDS-PAGE进行分离。50、38、24和18–13 kDa的蛋白条带被切下并从凝胶中提取，方法如Scheer和Ryan所述（14）。18–13 kDa范围内的糖蛋白（5–10微克）经额外的12.5% SDS-PAGE以分离18、14和13 kDa蛋白。

六种纯化的蛋白（50、38、24、18、

蛋白质纯化与糖链组成

通过制备电泳将六种扁豆凝集素特异性猪带绦虫囊肿糖蛋白（50、38、24、18、14和13 kDa）纯化至均一性（图1A，采用自参考文献8我们早期工作），并通过免疫印迹（图1B，采用自参考文献8我们早期工作）确定其免疫原性。从240 ± 8.5微克总蛋白中，高分子量蛋白（50–24 kDa）的产率为17.5 ± 2.5微克蛋白，低分子量蛋白的产率为7.5 ± 2.5微克

讨论

NCC与获得性癫痫相关，构成重大的全球健康负担，但其诊断仍面临挑战，特别是在少囊感染病例中^{21, 22}。当前NCC的诊断标准包括血清学EITB^{3, 8, 17}，尽管它在检测单发、钙化或消退的囊肿感染方面效果有限，在这些情况下囊虫抗体水平可能较低。NCC大多数血清免疫检测的一个显著局限性，包括

CRediT作者贡献声明

Vedantam Rajshekhar：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，验证，监督，资源，项目管理，数据整理，概念化。Anna Oommen：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，验证，监督，资源，项目管理，方法学，调查研究，资金获取，数据整理，概念化。Ranjith Moorthy：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，资源，项目管理，调查研究，

伦理声明

已获得所有参与者或其法定代表人的书面知情同意，同意参与本研究并发表文章。参与者的隐私权得到了尊重。

本研究包含器官或组织供体。本研究包含人类生物材料，已获得供体或其近亲或法定代表人的同意，同意在本研究中使用并发表文章。本研究中使用的样本未来源于被处决的

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报告的工作。

Subashini Thamizhmaran|Betcy Evangeline Pamela|Ranjith K. Moorthy|Vedantam Rajshekhar|Anna Oommen|Prabhakaran Vasudevan