利用跨物种累积分布法筛查蚯蚓对六价铬（Cr(VI)）反应的敏感测试指标

《Environmental Pollution》：Screening sensitive testing endpoints for Cr(VI) responses in earthworms using cross-species cumulative distributions

　　摘要
六价铬（Cr(VI) 是一种优先关注的土壤污染物，然而当前的蚯蚓毒性评估仍然主要依赖于单一物种的顶端效应指标。在这项研究中，我们系统地比较了12种蚯蚓物种对六价铬的敏感性，这些物种代表了地表、地下和地下栖息的生活方式，并使用了四种响应指标来评估不同生物组织层次的敏感性：生长抑制（EC50）、乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制、蛋白质二级结构改变（圆二色性，CD）和体腔液渗透压。针对每个指标，使用对数逻辑模型拟合了特定物种的暴露-响应曲线，以得出EC50值。这些特定物种的EC50值通过累积分布进行了总结。生长抑制分布被解释为一种敏感性分布（SSD），而生物化学和生理指标则通过累积频率分布进行总结。在12种物种中，EC50值表现出明显的种间差异，其中生长抑制的种间差异约为2.6倍，而AChE抑制的种间差异约为27倍。在当前的数据集中，对AChE抑制最敏感的物种是赤色蚯蚓（Lumbricus rubellus，EC50 = 10.21 mg kg?1），而最不敏感的物种是大地蚯蚓（Lumbricus terrestris，EC50 = 280.44 mg kg?1）。生物化学和生理响应指标的5%分位数比28天生长抑制指标更低，其响应顺序为：AChE抑制 < 蛋白质二级结构改变 < 体腔液渗透压偏差 < 生长抑制。基于AChE的5%分位数（P5）比生长抑制的50%分位数（HC5）低大约一个数量级，表明AChE生物标志物在比28天生长响应更低的六价铬浓度下表现出反应。结果表明，基于AChE的P5是所有评估的生物化学和生理响应指标中最低的特定指标分位数，而50%分位数的比较进一步支持了它们相对于生长抑制具有更高的浓度敏感性，为土壤六价铬效应评估的指标选择提供了机制信息。

引言
由于电镀、皮革鞣制、金属冶炼和铬酸盐生产等密集的工业活动，铬（Cr）污染在陆地生态系统中已成为一个日益严重的问题（Lai等人，2018年）。在其各种氧化态中，六价铬（Cr(VI) 特别令人担忧，因为它具有高溶解度、移动性和毒性，对土壤生物群和生态系统功能构成重大威胁（Stohs等人，2001年）。关于铬毒性的研究表明，对于同一物种，不同的测试指标可能得出明显不同的效应浓度，这强调了使用生物学上合适的跨物种响应分布来比较指标敏感性的必要性。这样的方法为严格评估铬污染土壤的影响提供了坚实的科学基础。因此，了解六价铬在个体和种群层面的毒性对于建立基于科学的土壤保护阈值至关重要。
蚯蚓被广泛认为是关键的土壤工程师，在凋落物分解、营养循环和土壤结构维持中发挥着重要作用（Fonte等人，2023年）。它们与土壤颗粒的密切接触、高生物累积能力和生态重要性使它们成为评估土壤污染物危害的宝贵生物标志物（Shan等人，2010年；Gu等人，2016年）。许多研究调查了重金属对蚯蚓的毒性效应，通常关注单一的生物学指标，如生长、繁殖或特定的生物化学标志物（Yadav等人，2023年；Sujeeth等人，2025年）。然而，六价铬可以引发多层面的生物扰动，包括氧化应激和蛋白质水平的紊乱，这些可能影响神经功能生物标志物，以及蛋白质结构改变和生理失衡。

选择了四个指标来代表六价铬引起的生物扰动的不同响应领域。乙酰胆碱酯酶（AChE）活性被用作神经功能生物标志物，因为胆碱酯酶活性的变化可以指示蚯蚓神经肌肉调节和摄食相关功能的紊乱（Rault等人，2007年）。尽管六价铬不是典型的有机磷类AChE抑制剂，但六价铬引起的氧化应激和金属相关的蛋白质功能障碍可能会改变酶活性（Sivakumar和Subbhuraam，2005年；Tian等人，2024年）。通过圆二色性测量的蛋白质二级结构改变反映了由氧化反应和金属-蛋白质相互作用引起的可溶性蛋白质分数的变化（Greenfield，2006年）。体腔液渗透压被选为生理指标，因为体腔液在蚯蚓的内部渗透压和离子调节中起着重要作用，体腔细胞/体腔液的响应已被用于评估金属引起的蚯蚓应激（Ramsay，1949年；Homa等人，2005年）。生长抑制被保留作为个体层面的顶端指标，因为它整合了摄食、代谢和生物量维持的累积损伤。这些生物化学和生理指标并不被视为与生长、存活或繁殖等同的不良反应结果，而是作为比较六价铬应激下指标敏感性的机制响应指标。因此，本研究的目的不是建立将生物标志物变化与生长、存活或繁殖联系起来的完整不良反应途径。虽然之前的蚯蚓研究中分别研究了生物化学和生理生物标志物，但对于分子、生物化学和生理响应指标是否在比传统顶端指标（如28天生长抑制）更低的浓度下反应知之甚少。物种敏感性分布（SSD）模型已广泛用于生态风险评估和危险浓度阈值（如HC5）的确定（Albarano等人，2025年；Fox等人，2020年）。尽管已经为多种化学物质构建了SSD（Khan等人，2025年），但跨物种的累积分布很少用于比较蚯蚓中的多个生物响应指标，尤其是在代表不同生态策略的物种之间。更重要的是，尚未使用共同的跨物种累积分布框架系统地比较六价铬的不同生物指标的相对敏感性。

在这项研究中，我们比较了12种代表地表、地下和地下栖息生态类别的蚯蚓物种的特定指标响应模式。研究了四个指标，包括28天生长抑制、AChE抑制、蛋白质二级结构改变和体腔液渗透压。我们没有假设生物化学或生理生物标志物是调节性危险指标，而是将它们作为机制响应指标，以评估六价铬引起的生物化学和生理扰动是否在比个体层面生长抑制更低的名义暴露浓度下发生。然而，这些生物化学和生理生物标志物本身并不被视为不良反应结果；相反，它们被用作机制响应指标，以帮助解释可能在比生长抑制、存活减少或繁殖受损等顶端结果更低的名义暴露浓度下发生的六价铬引起的扰动。因此，这些生物化学和生理指标用于比较六价铬应激下的指标敏感性，而不是建立将生物标志物变化与生长、存活或繁殖联系起来的完整不良反应途径。这种比较框架能够评估特定指标的响应模式，并为选择有信息量的土壤六价铬效应评估响应指标提供实验支持。研究结果加深了我们对蚯蚓物种多层面六价铬诱导响应的理解，并为改进土壤六价铬生态效应评估中的指标选择提供了数据基础。

实验材料
本研究使用的试验土壤是一种典型的肉桂色土壤，取自中国北京一个农田的0-20厘米表层（地理坐标：40.53°N，116.21°E）。土壤在室温下风干大约7天，直到达到风干状态，然后轻轻压碎并通过2毫米筛子过滤后使用。在添加六价铬之前，确定了土壤的主要物理化学性质。土壤pH值是在土壤/去离子水中测量的。

六价铬对蚯蚓的毒性效应
从拟合的暴露-响应模型得出的28天生长抑制EC50值在物种间范围内的变化为304.8至812.9 mg kg?1，对应的种间敏感性差异约为2.7倍（图1）。最敏感的物种是赤色蚯蚓（EC50 = 304.8 mg kg?1，95% CI：243.9-381.1 mg kg?1），其次是Bimastus parvus（325.2 mg kg?1，95% CI：260.1-406.5 mg kg?1）、Eisenia andrei（345.5 mg kg?1，95% CI：255.9-466.4 mg kg?1）、E. fetida（365.8 mg kg?1，95%）。

生长抑制被视为个体层面的顶端响应，而AChE抑制、蛋白质二级结构改变和体腔液渗透压被解释为机制响应指标。它们的较低P5值表明，在当前数据集中，生物化学和生理扰动发生在比28天生长抑制更低的六价铬暴露浓度下。然而，这些生物标志物响应本身并不能确定不良反应结果或因果关系。

结论
本研究使用四个亚致死指标比较了12种蚯蚓对六价铬的响应：生长抑制、AChE抑制、蛋白质二级结构改变和体腔液渗透压。结果表明，生物化学和生理响应指标在比28天生长抑制更低的名义暴露浓度下检测到了六价铬引起的功能扰动，表明这些指标在当前数据集中具有更高的浓度敏感性。

声明
代表所有作者，我们声明本文描述的工作是原创的，尚未在其他地方发表，除非符合期刊的政策。该 manuscript 目前没有在其他地方接受发表。所有作者都已阅读并批准了最终修订版的手稿，并同意将其提交给《环境污染》杂志。这项工作的提交和发表已得到所有作者的批准，必要时已获得CRediT的作者贡献声明。

Lei Yu：撰写——原始草稿、调查、数据管理。Meng Wang：撰写——原始草稿、调查、数据管理。Luyao Qin：方法学、概念化。Xiaoyi Sun：验证、概念化。Jing Wang：撰写——审稿与编辑。Jiaxiao Liu：验证。Ruyan Zhou：撰写——审稿与编辑。Jingze Li：验证、软件。Xuedong Wang：验证。Shibao Chen：验证。

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。

致谢
这项工作得到了中国国家重点研发计划（2023YFC3708703 & 2024YFD1700902）的支持。

Lei Yu | Meng Wang | Luyao Qin | Xiaoyi Sun | Jing Wang | Jiaxiao Liu | Ruyan Zhou | Jingze Li | Xuedong Wang | Shibao Chen
中国农业科学院农业资源与区域规划研究所，高效利用耕地国家重点实验室，北京，100081，中国