藜中对乙草胺的靶基因突变及代谢增强型抗性

《Crop Protection》：Target-gene mutation and enhanced metabolism-based resistance to imazethapyr in Chenopodium album L

　　

摘要

Chenopodium album L. 是影响中国农业系统最为广泛且破坏性最大的杂草之一。本文鉴定了两种对吡氟草胺耐药的C. album基因型(R1和R2)，两者均表现出极高的抗性水平，与敏感野生型相比，其耐药指数(GR₅₀ R/S)为16.04至18.15倍。使用细胞色素P450 (CYP450)抑制剂可显著恢复植物对吡氟草胺(IMA)的敏感性，表明代谢解毒作用增强参与其中。丙酮羟基酸合酶(AHAS)酶活性测定结果与整株生物测定结果一致。对AHAS基因的序列分析揭示了R2基因型中一种新的W⁵⁷⁴L替换。分子对接分析表明，该突变改变了CaAHAS与IMA之间的结合自由能。W⁵⁷⁴L变异对支链氨基酸(BCAAs)反馈抑制的敏感性降低，尽管该突变并未在IMA暴露下直接破坏BCAAs的合成。耐药性主要与CaAHAS对IMA的敏感性降低以及对底物丙酮酸的亲和力增加有关。此外，W⁵⁷⁴L突变在Arabidopsis thaliana中的异源表达赋予了其对IMA的抗性。本研究首次提供了证据，表明W⁵⁷⁴L突变与增强的代谢解毒作用共同促进了C. album对吡氟草胺的抗性。

引言

除草剂在现代农业中的广泛和密集应用，导致除草剂耐药杂草种群的数量和多样性迅速增加(Ofosu et al., 2023)。杂草抗性机制通常分为靶标抗性(TSR)和非靶标抗性(NTSR)(Yuan et al., 2007)。TSR包括靶标基因突变、靶标酶过表达或靶标基因扩增等改变，其中靶标蛋白的点突变最为常见(Gaines et al., 2020)。相比之下，NTSR机制通过减少吸收或转运、增强代谢解毒，或通过物理或生化方式保护靶标酶，来限制靶标处除草剂的有效浓度(Ghanizadeh and Harrington, 2017; Rigon et al., 2020)。

丙酮羟基酸合酶(AHAS; EC 2.2.1.6)是几种主要除草剂类别的分子靶标，催化支链氨基酸(BCAAs)生物合成的第一个承诺步骤(Liu et al., 2016; Tan et al., 2024)。AHAS包括催化亚基(CSU)和调节亚基(RSU)；尽管RSU缺乏催化活性，但它调节BCAAs合成并负调控CSU活性(Yoon et al., 2010; Zhang et al., 2020; Lonhienne et al., 2020)。凭借其广谱除草、高效和有利的毒理学特性，AHAS抑制除草剂产生的抗除草剂杂草物种多于任何其他除草剂组。这些除草剂分为五个化学家族：磺酰脲类(SU)、咪唑啉酮类(IMI)、嘧啶基硫苯甲酸酯类(PTB)、三唑嘧啶磺酰胺类(TP)和磺胺羰基三唑啉酮类(SCT)(Garcia et al., 2017)。它们均结合在AHAS的重叠区域，使得该酶极易发生赋予抗性的突变(Schloss et al., 1988; Yu and Powles, 2014)。迄今为止，包括A¹²²、P¹⁹⁷、A²⁰⁵、F²⁰⁶、D³⁷⁶、R³⁷⁷、W⁵⁷⁴、S⁶⁵³和G⁶⁵⁴在内的24个氨基酸位点已被发现与AHAS抑制剂抗性有关，产生了至少31种不同的替换变异(Murphy and Tranel, 2019; Fang et al., 2022; Heap, 2026; Tranel et al., 2026)。这些变化改变了AHAS的构象，在保持底物周转的同时减少了除草剂的结合，从而为抗性提供了分子基础(Lonhienne et al., 2018, 2022)。

Chenopodium album L.，苋科的一年生植物，俗称“灰灰菜”，是全世界最具危害的杂草之一，广泛分布于热带、亚热带和温带地区(Bajwa et al., 2019; Wei et al., 2023)。它在早春至春中出土，主要为自花授粉，产生的种子寿命长，可在土壤中存活数十年(Yerka et al., 2012; Jhala et al., 2021)。在中国，C. album是一种主要的农业害虫，与作物激烈竞争，导致严重的产量和品质损失(Damalas and Koutroubas, 2022)。尽管其重要性显著，但针对其对AHAS抑制除草剂抗性机制的研究很少，迄今为止仅报道了A¹²²T突变(Huang et al., 2020; Cao et al., 2022)。本研究旨在：(1) 表征CaAHAS的酶动力学、催化活性、对BCAAs的反馈抑制以及与IMA的分子对接；(2) 确定C. album对AHAS抑制剂抗性的TSR和NTSR机制；以及(3) 评估除草剂代谢增强对抗性的贡献。

章节片段

植物材料

从我国东北部黑龙江省的多个农业地点收集了C. album的种子(补充表1)。对吡氟草胺(IMA, 10% AS, 山西绿海农药科技有限公司, 中国山西)按100.5 g a.i. ha^?1的剂量处理后的存活单株种子被采收，并保存在4°C以进行后续分析。种植前，种子在5%的高氯酸钠(NaClO₃)中进行表面灭菌，并用蒸馏水冲洗三至四次。

加/不加马拉硫磷时整株对IMA的剂量反应

整株生物测定表明，敏感基因型受到IMA的强烈抑制，而两种耐药基因型均表现出极高的耐受性(图1A)。敏感种群的GR₅₀值为21.18 g a.i. ha^?1，而耐药基因型的GR₅₀值分别达到339.75和392.14 g a.i. ha^?1(图1B)。当用一种细胞色素P450抑制剂马拉硫磷(1000 g a.i. ha^?1)预处理植物时，两种耐药基因型的GR₅₀值明显下降

讨论

AHAS抑制除草剂因其广谱除草、高效和对哺乳动物低毒性而被广泛使用，但对该类除草剂的抗性已成为一个全球性问题(Norsworthy et al., 2012)。基于马拉硫磷的逆转测定通常用于诊断由细胞色素P450酶介导的代谢抗性(Torra et al., 2021; Guan et al., 2024)。在本研究中，马拉硫磷预处理(1000 g a.i. ha^?1)显著降低了R1和R2的GR₅₀值，

结论

总之，AHAS中的W⁵⁷⁴L替换赋予C. album对IMA的抗性，表达该等位基因的转基因A. thaliana也表现出对IMA的强耐受性。该突变通过增加CaAHAS对丙酮酸的亲和力和/或减弱除草剂结合，产生对AHAS抑制除草剂的广泛交互抗性。尽管CaAHAS对BCAAs反馈抑制的敏感性取决于特定的氨基酸替换，但这些变化对耐药C. 中游离BCAAs水平的影响微乎其微。

CRediT作者贡献声明

Zhonghua Sun：构思、形式分析、获取资金、方法学、撰写初稿。Xuelian Liu：数据管理、调查研究、软件。Zhen Meng：数据管理、调查研究、软件。Di Ma：验证。Xiaofeng Xu：获取资金、验证。Zhihua Liu：获取资金、指导。Chunhong Teng：构思、获取资金、撰写 – 审阅与编辑。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本研究由国家重点研发计划(2024YFD1501003-03)、黑龙江省自然科学基金(LH2024C009)和东北农业大学“青年人才”项目(22QC04和21QC02)资助。作者声明没有利益冲突。

孙中华|刘雪莲|孟震|马迪|徐晓峰|刘志华|滕春红

东北农业大学植物保护学院，哈尔滨，150030，中国