TRPM4 促进 Dukes C 期结直肠癌肿瘤球的形成与向外生长

《Cell Calcium》：TRPM4 contributes to the formation and outgrowth of Dukes’ stage C colorectal cancer tumor spheroids

　　

• TRPM4敲除（KO）增加储存操控的Ca²⁺信号（store-operated Ca²⁺ signaling），并在两种Dukes C期结直肠癌（colorectal cancer，CRC）细胞系中对二维癌症标志功能产生不同的影响。
• 在两种CRC细胞系中，缺乏TRPM4会减少肿瘤球形成（tumor spheroid formation）。
• TRPM4有助于两种CRC细胞系中的肿瘤球向外生长（tumor spheroid outgrowth）。
• 两种CRC细胞系具有独特的遗传背景，TRPM4 KO差异性地影响基因表达模式。
• 在评估TRPM4作为CRC潜在治疗靶点时，了解个体患者的遗传背景对于先进的个性化医学方法至关重要。

TRPM4在Dukes C期结直肠癌肿瘤球形成与向外生长中的作用——论文解读

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大原因，转移是导致患者死亡的主要因素。瞬时受体电位M4型通道（transient receptor potential melastatin-4，TRPM4）是一种由胞内Ca²⁺激活的质膜阳离子通道，主要介导Na⁺内流，引起膜去极化并抑制钙库操控的Ca²⁺内流（store-operated Ca²⁺ entry，SOCE）。TRPM4在多种肿瘤中表达异常并发挥背景依赖性作用，但在晚期CRC中的作用尚不清楚。基于此，研究人员利用两种Dukes C期CRC细胞系DLD-1和LoVo，通过CRISPR/Cas9技术敲除TRPM4，在二维（2D）和三维（3D）培养条件下系统评估其对肿瘤球形成和向外生长的影响，旨在明确TRPM4作为CRC潜在治疗靶点的价值。该研究发表于《Cell Calcium》。

研究人员首先通过cBioPortal数据库分析CRC细胞系中TRPM4 mRNA表达水平，发现其表达与Dukes分期无明显相关性。随后构建了TRPM4敲除（KO）克隆，通过全细胞膜片钳记录确认ICAN电流完全消失，证明两种细胞系中该电流均由TRPM4介导。钙成像实验表明，TRPM4敲除可增强储库操控的Ca²⁺信号。在2D功能层面，TRPM4敲除对DLD-1和LoVo的增殖、粘附、迁移和代谢活性产生不同甚至相反的影响。在3D培养体系中，TRPM4敲除一致性地减少了两种细胞系的肿瘤球尺寸，并减弱了肿瘤球向外生长能力。基因表达分析显示，两种细胞系具有独特的遗传背景，TRPM4敲除后与WNT/β-catenin、上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等相关基因的表达变化亦存在显著差异。

研究采用的主要关键技术方法包括：利用CRISPR/Cas9技术（靶向外显子3）在DLD-1和LoVo细胞中敲除TRPM4；全细胞膜片钳记录Ca²⁺激活的非选择性阳离子电流（ICAN）；Fura-2荧光成像检测细胞内Ca²⁺动态；xCELLigence RTCA DP实时监测细胞增殖、粘附与迁移；RealTime-Glo法评估代谢活性；Seahorse XF分析线粒体耗氧率（OCR）；超低吸附板培养形成3D肿瘤球并测量其大小与向外生长面积；RT-qPCR检测癌症相关基因表达。所有细胞系均购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。

**3.1 TRPM4在CRC细胞系中的表达**：基于cBioPortal数据分析发现，TRPM4 mRNA表达在相同或不同Dukes分期的细胞系中均存在差异，提示其表达不受分期严格调控。Western blot结果显示HCT 116细胞TRPM4蛋白水平最高，DLD-1居中，LoVo最低，但总体差异不大。

**3.2 TRPM4介导ICAN并调节时控性Ca²⁺信号、代谢活性及差异影响增殖和迁移**：全细胞膜片钳证实10 μM胞内Ca²⁺可激活ICAN，而TRPM4敲除克隆中电流完全缺失。在缩短的钙回补方案中，TRPM4敲除显著增强两种细胞系的储存操控性Ca²⁺信号。功能实验显示，DLD-1敲除后迁移和代谢活性降低，而LoVo敲除后增殖、粘附和迁移增加，但代谢活性下降。

**3.3 TRPM4改变线粒体氧化磷酸化**：Seahorse实验表明，DLD-1 TRPM4敲除克隆的最大呼吸能力和备用呼吸能力显著升高，而LoVo敲除克隆则显著降低，说明TRPM4对线粒体应激反应的影响具有细胞背景依赖性。

**3.4 TRPM4调节3D肿瘤球形成和大小**：在超低吸附培养条件下，TRPM4敲除使DLD-1和LoVo肿瘤球的尺寸明显减小，其中LoVo敲除后肿瘤球大小约减少50%，表明TRPM4促进肿瘤球形成。

**3.5 TRPM4调节肿瘤球向外生长**：将肿瘤球转移至贴壁培养板后，TRPM4敲除肿瘤球的内、外面积均减小，尤其以LoVo敲除克隆最为显著，提示TRPM4参与肿瘤细胞的粘附、迁移和向外扩散过程。

**3.6 TRPM4缺失对DLD-1和LoVo基因表达的影响**：RT-qPCR结果显示，在DLD-1敲除克隆中，GJB1、APC和CD47表达上调，CTNNB1和FN1表达下调；在LoVo敲除克隆中，APC、VIM、CDH2和SNAI1表达下调，CD44和FN1表达上调。这些差异进一步反映两种细胞系遗传背景的不同。

讨论部分指出，3D培养模型比2D培养更接近体内肿瘤结构。TRPM4在早期CRC细胞中的作用与本研究结果不完全一致，可能与DLD-1和LoVo具有不同的APC突变状态有关。高浓度TRPM4抑制剂（PBA和CMP233）对肿瘤球形成的抑制作用在TRPM4敲除细胞中同样存在，提示其作用并非TRPM4特异性。尽管存在遗传背景差异，TRPM4缺失导致肿瘤球形成和向外生长减弱的效应在两种细胞系中高度一致，提示TRPM4在CRC进展中具有潜在推动作用。

研究结论部分可概括为：TRPM4是CRC的一个有前景的治疗靶点；TRPM4敲除降低肿瘤球大小和向外生长能力，表明其在肿瘤进展中发挥作用。在未来的个性化医学中，了解患者个体的遗传背景对于验证TRPM4作为CRC治疗靶点至关重要。后续研究应进一步探讨TRPM4活性如何依赖于关键CRC相关突变，并评估TRPM4单独或与其他分子标志物联合是否可作为可靠的预后生物标志物或化疗反应预测因子。