Rg3通过TFEB介导的溶酶体自噬途径抑制胃癌进展

《Cellular Signalling》：Rg3 suppresses gastric cancer progression via TFEB-mediated lysosomal autophagy pathway

　　

摘要

背景

胃癌（GC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率都很高。Rg3是从人参中提取的一种天然活性成分，已在多种恶性肿瘤中显示出抗肿瘤作用。然而，其在胃癌中的具体功能及其潜在的分子机制尚未完全阐明。

方法

通过CCK-8检测、菌落形成、EdU染色、流式细胞术和Western blot分析，研究了Rg3对AGS细胞的存活能力、增殖能力、凋亡进程和自噬相关蛋白表达的影响。为了研究Rg3与TFEB之间的直接相互作用，以及Rg3通过溶酶体自噬调控凋亡的机制，采用了分子对接、CETSA、免疫荧光、mRFP-GFP-LC3双标记系统、LysoTracker/Magic Red染色和基因敲低/过表达等方法。通过Western blot分析AKT/mTOR通路相关蛋白的表达情况。建立了裸鼠异种移植肿瘤模型以监测肿瘤发展，同时使用H&E染色和IHC来观察组织病理变化和关键蛋白的表达。

结果

Rg3以浓度依赖的方式抑制AGS细胞的增殖，诱导细胞凋亡，并抑制AKT/mTOR通路。机制研究表明，Rg3一方面通过抑制AKT/mTOR通路减少TFEB的磷酸化，从而促进TFEB向细胞核迁移；另一方面与TFEB结合，增强其蛋白稳定性，维持TFEB的活化状态，并上调TFEB蛋白表达，进而激活溶酶体自噬通路。TFEB敲低可逆转Rg3介导的自噬激活、凋亡诱导和肿瘤发展抑制作用，而TFEB过表达则再现了这些效应，但这些效应可被自噬抑制剂氯喹消除。体内实验进一步证实，Rg3显著抑制了异种移植肿瘤的发展，同时肿瘤组织中TFEB和LC3B的表达上调，Ki67水平下调，Bax水平升高。

结论

Rg3上调并激活TFEB，从而触发溶酶体自噬通路，最终诱导胃癌细胞凋亡并抑制肿瘤进展。

引言

胃癌（GC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均处于对人类健康构成威胁的前沿[1]。大多数病例在晚期才被发现，因此错过了最佳手术时机[2]。对于接受手术切除的患者，术后通常会给予辅助化疗或同步化放疗以降低复发风险并提高生存率[3]。尽管诊断策略不断进步，胃癌的整体预后仍不理想，复发和转移仍然是一个主要的治疗挑战[4]。因此，深入探讨调控胃癌发生和进展的分子机制，以及寻找高效低毒的新疗法及其靶点，已成为当前胃癌研究的重要焦点。

中医包含多种具有复杂作用机制的成分，对肿瘤发生、进展、转移和免疫调节具有多方面的调控作用[5]。人参皂苷Rg3是从人参根中提取的一种重要活性成分[6]，具有显著的抗肿瘤、抗炎、抗氧化和免疫调节作用[7]。Rg3通过多种机制抑制肿瘤进展：在非小细胞肺癌中，Rg3靶向并抑制PD-L1的糖基化，从而增强抗肿瘤免疫[8]；在黑色素瘤中，Rg3通过触发p53/SLC7A11/GPX4信号通路诱导铁死亡，从而阻碍肿瘤发展[9]。此外，富含Rg3的人参提取物通过抑制保护性自噬来增强CoCl₂诱导的乳腺癌细胞凋亡[10]。然而，Rg3在胃癌中的具体作用机制，特别是它是否通过调节自噬通路来影响肿瘤进展，仍不完全清楚。

自噬是一种通过降解多余或受损的细胞成分来维持稳态的关键细胞过程[11]。在自噬过程中，错误折叠的蛋白质和受损的细胞器被包裹在双膜自噬体中，随后在溶酶体中降解[11]。溶酶体自噬作为自噬级联反应中的关键节点，对维持自噬通量的连续性至关重要[12]。TFEB被认为是自噬和溶酶体生物生成的主要调节因子[13]，在溶酶体贮积障碍中可恢复自噬活性[14]。TFEB介导的溶酶体自噬可促进急性膝关节损伤后的组织修复[15]。Chen等人[16]进一步研究表明，阿魏酸可减轻顺铂引起的肾纤维化，并通过改善TFEB依赖的自噬-溶酶体通路增强其抗肿瘤效果。然而，TFEB是否参与Rg3在胃癌中的抗肿瘤作用尚不明确。

本研究旨在阐明Rg3通过上调和激活TFEB，抑制AKT/mTOR通路介导的TFEB磷酸化，进而激活溶酶体自噬通路来诱导胃癌细胞凋亡和抑制肿瘤进展的分子机制。这一发现不仅揭示了Rg3-TFEB-溶酶体自噬轴在胃癌中的新调控作用，还为基于该通路开发胃癌靶向治疗策略提供了新的理论基础和潜在干预靶点。

节选内容

细胞培养与处理

人类胃癌细胞系AGS（iCell-h016，iCell，中国）在含有10% FBS（HyClone，美国）和1%青霉素-链霉素（Gibco，美国）的F12K培养基（Gibco，美国）中培养。培养条件为37°C恒温下的5% CO₂环境。20(S)-人参皂苷Rg3（HY-N0603）和10 μM自噬抑制剂氯喹（CQ，HY-17589 A）来自MedChemExpress（美国）。体外实验所用溶液均制备在无血清培养基中。

Rg3促进胃癌细胞凋亡

为了研究Rg3对AGS细胞的生物学效应，通过CCK-8检测了不同浓度Rg3处理48小时和72小时后对细胞存活的影响。结果显示，Rg3以浓度和时间依赖的方式降低AGS细胞存活率。48小时暴露后的半最大抑制浓度（IC₅₀）为22.04 μM，72小时后降至15.87 μM（图1A）。基于这些结果，后续实验使用了20 μM的Rg3。

讨论

本研究表明，Rg3通过抑制AKT/mTOR信号通路减少TFEB的磷酸化，同时上调并激活TFEB，从而驱动溶酶体自噬通路，最终诱导胃癌细胞凋亡并抑制肿瘤进展。通过阐明Rg3-TFEB-溶酶体自噬轴在胃癌进展中的调控作用，为针对TFEB的胃癌干预策略提供了新的研究方向。

伦理声明

所有动物实验程序均经过浙江省人民医院（杭州医学院附属医院）的动物伦理委员会（批准编号：）的审查和批准，并严格遵循《实验动物护理和使用指南》。

CRediT作者贡献声明

詹媛：撰写——初稿、验证、软件应用、方法学设计、数据分析、概念构建。许阳贤：撰写——审稿与编辑、监督、软件应用、方法学设计、数据分析。刁艺哲：撰写——审稿与编辑、验证、软件应用、资源准备、实验设计、数据分析。丁涛：数据可视化、验证、资源准备、实验设计、数据分析。袁国荣：数据可视化、验证、软件应用、项目管理。

资助声明

本研究未获得任何资助。

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。

詹媛|许阳贤|刁艺哲|丁涛|袁国荣

上海中医药大学龙华医院普通外科，上海，中国