神经球蛋白正向调控YTHDF3以恢复线粒体自噬并抑制七氟醚诱导的发育神经毒性中的铁死亡

《Chemico-Biological Interactions》：Neuroglobin positively regulates YTHDF3 to restore mitophagy and suppress ferroptosis in sevoflurane-induced developmental neurotoxicity

　　

七氟醚诱导的发育性神经毒性以线粒体自噬受损和铁死亡过度激活为特征。神经球蛋白（NGB）具有广泛的神经保护作用，但其对抗七氟醚损伤的确切表观转录组调控机制尚不明确。本研究采用两套互补的实验体系，分别用于体外机制探索和体内生理验证，两者总七氟醚暴露时长相同。HT22海马神经元接受6小时不间断七氟醚孵育，而新生大鼠则接受每日2小时间断吸入、连续三天的处理。我们构建了慢病毒系统以过表达或敲低NGB/YTHDF3，随后检测细胞活力、线粒体功能、活性氧（ROS）、铁水平及通路生物标志物。免疫共沉淀验证了NGB与m6A阅读器蛋白YTHDF3之间的内源性蛋白互作，体内实验进一步检测了海马线粒体自噬、铁死亡指标及线粒体超微结构。体外实验表明，NGB通过两条独立的级联途径减轻七氟醚触发的线粒体损伤和神经元死亡：NGB通过与YTHDF3相互作用并正向调控其蛋白表达来恢复线粒体自噬并抑制铁死亡；同时，其内在抗氧化活性以YTHDF3非依赖方式提高细胞活力并清除ROS。总体而言，本研究描述了一种NGB-YTHDF3表观转录组调控机制，可减轻七氟醚触发的发育性神经毒性，为儿科脑保护提供了治疗启示。

**引言**

全球每年有数以万计的婴幼儿接受全身麻醉手术[1, 2]。新生儿期是中枢神经系统成熟的关键窗口期，表现为神经干细胞增殖旺盛、突触发生和神经回路构建活跃——这些过程为一生的学习和记忆功能奠定了基础。因此，吸入性麻醉药在儿科患者中的神经毒性风险已引起广泛的研究关注[3]。临床前研究长期记录了反复暴露于儿科麻醉药后持续的神经元损伤。2016年美国食品药品监督管理局（FDA）发布的官方警告进一步强化了这些转化医学方面的担忧，指出3岁以下儿童长时间或反复使用麻醉可能对尚未成熟的脑发育造成风险[4]。然而，现有的临床前研究尚未确定能够减轻此类麻醉诱导神经损伤的安全、可药化的内源性保护靶点。

七氟醚因其气味温和、起效快、苏醒快的特点，成为儿科手术的首选吸入麻醉药[5]。不断积累的术前证据证实了其固有的神经毒性潜力。反复或长时间暴露于七氟醚会导致海马神经元凋亡、突触可塑性受损和脑代谢紊乱，最终导致发育中大脑出现持续性的认知缺陷[6, 7]。已发表的数据表明，七氟醚破坏线粒体稳态，从而在新出生啮齿动物模型中触发神经元凋亡和永久性的发育性脑损伤[8, 9]。尽管取得了这些进展，七氟醚诱导发育性神经毒性的分子机制仍不完全清楚，亟需有效的神经保护策略。

铁死亡是一种新近发现的铁和活性氧依赖的受控细胞死亡方式，其特征为细胞体积缩小、线粒体嵴丢失、线粒体外膜破裂以及线粒体膜密度升高[10, 11]。越来越多的研究表明，反复暴露于七氟醚可引发神经元铁死亡[12]，而靶向抑制铁死亡代表了预防七氟醚诱导脑损伤的一种有前景的干预策略[13]。铁死亡被普遍认为是一种主要的神经退行性变和认知功能障碍的驱动因素。近期的综述进一步巩固了铁死亡与神经退行性疾病中认知功能障碍之间的因果联系，证明铁稳态失调和脂质过氧化是记忆缺陷的汇聚性病理驱动因素[14, 15]。线粒体自噬是清除受损线粒体的主要质量控制通路。线粒体自噬受损以及功能障碍线粒体的积聚可轻易驱动铁死亡性细胞死亡[16]。PINK1/Parkin级联是最为特征明确的线粒体自噬信号轴，激活PINK1/Parkin介导的线粒体自噬可发挥强效的抗铁死亡神经保护作用[17, 18, 19]。综述文章总结了线粒体自噬在神经退行性疾病中的小分子调节剂[20]。

现有的动物研究证实，七氟醚暴露抑制PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬并诱导认知功能障碍，而药理学增强线粒体自噬可有效减轻七氟醚介导的神经毒性[21]。值得注意的是，线粒体自噬功能障碍和铁死亡形成一个相互放大的正反馈回路，而非简单的线性病理级联[14]。线粒体自噬受阻导致的受损线粒体释放不稳定铁和脂质过氧化物，从而启动铁死亡；反过来，脂质过氧化产物破坏线粒体膜电位并阻碍PINK1-Parkin的募集，进一步加重线粒体损伤。除这一核心恶性循环外，CASTOR1/mTORC1轴已被证实是化学毒性刺激下GPX4稳定性和铁死亡起始的关键上游调节因子[22]。此外，细胞内钙稳态的破坏是多种毒物损伤模型中线粒体功能障碍和后续氧化损伤的早期触发因素。一种保守的钙-线粒体-ROS级联途径被各种外源性神经毒素所共有，依次触发钙超载、线粒体崩解和过量ROS产生，从而损害未成熟的神经元[23]。尽管取得了这些进展，能够打破线粒体自噬-铁死亡病理循环的上游分子开关仍未明确。

N6-甲基腺苷（m6A）是哺乳动物细胞中最丰富的内部转录后RNA修饰，对胎儿脑发育至关重要，并介导多种神经毒性应激反应[24, 25]。累积的临床前数据表明，m6A表观转录组重塑参与了七氟醚触发的发育性神经损伤，在反复七氟醚给药后于未成熟海马中检测到动态m6A修饰[26, 27]。在功能上，经典m6A甲基转移酶METTL3和METTL14作为铁代谢和脂质过氧化的上游调节因子，直接调节氧化应激下神经元的铁死亡易感性[28, 29]。甲基转移酶在靶mRNA上沉积m6A标记，随后细胞质中的m6A阅读器蛋白解码修饰信号以调控线粒体稳态和铁死亡；YTHDF家族是介导这两个关键过程的主要效应蛋白群[30]。在YTHDF家族成员中，YTHDF3已成为麻醉神经毒性中特别相关的参与者。最近的体内研究证明，新生小鼠暴露于七氟醚会显著降低幼年小鼠大脑中的YTHDF3表达，表明YTHDF3耗竭与麻醉神经毒性之间存在因果联系[31]。尽管取得了这些进展，YTHDF3在发育神经元损伤中控制的下游信号网络仍知之甚少，且尚无研究将YTHDF3与儿科麻醉应激下的线粒体自噬-铁死亡恶性循环联系起来。

神经球蛋白（NGB）是一种神经元特异性氧结合球蛋白，是已被充分记录的可减轻缺氧和毒性损伤下铁依赖性铁死亡的神经保护因子[32]。多种神经保护分子通过重塑细胞代谢稳态发挥脑修复作用，这已通过创伤性脑损伤模型的代谢组学分析得到验证[33]。我们之前的新生啮齿动物体内研究证实，NGB过表达主要通过抑制神经元凋亡和稳定HIF-1α信号来减轻七氟醚诱导的认知缺陷[34]。然而，该先前的研究仅揭示了NGB的抗凋亡功能，忽略了其在线粒体质量控制和铁代谢中的潜在调控作用。现有对NGB的机制研究主要关注其抗凋亡和自由基清除能力；NGB是否通过m6A表观转录组调控调节线粒体自噬和铁死亡仍未被表征。值得注意的是，从BioGRID数据库中实验获得的蛋白互作数据的初步筛选中，YTHDF3被检索为NGB的候选结合伙伴；该条目源自已发表的亲和捕获-质谱数据集，但缺乏定量相互作用评分和结构结构域注释。这一生物信息学线索提出了一条尚未经测试的、连接神经球蛋白信号和表观转录组修饰的调控轴，我们在本研究中通过细胞免疫共沉淀实验对其进行了进一步验证。

鉴于上述背景，本研究旨在解决文献中的若干相互关联的空白。七氟醚神经毒性中控制线粒体自噬-铁死亡恶性循环的上游分子开关尚未被鉴定。NGB是否通过表观转录组机制调节线粒体自噬和铁死亡尚不明确，NGB与YTHDF3在发育神经元中的功能关系也从未被探索。为回答这些问题，本研究采用HT22海马神经元进行体外机制研究，并结合新生大鼠体内实验，在完整的发育中大脑中验证NGB-YTHDF3调控轴的生理相关性。阐明这一新型表观转录组神经保护环路可能为缓解儿科七氟醚麻醉引起的不可逆神经元损伤提供创新的分子靶点和治疗策略。

**部分片段**

**生物信息学蛋白-蛋白互作筛选**

使用BioGRID数据库（https://thebiogrid.org，5.0系列版本）筛选人类NGB的潜在互作蛋白，该数据库是一个公开可访问的实验验证蛋白互作仓库。我们将物种筛选条件设为智人，以神经球蛋白（NGB）为诱饵基因进行检索。YTHDF3被检索为候选互作伙伴之一。该记录相互作用的基础实验证据来源于高通量亲和捕获-质谱分析。

**七氟醚在HT22细胞中诱导线粒体自噬抑制和铁死亡相关变化**

HT22细胞暴露于3%七氟醚6小时后，细胞活力相对于对照组显著降低（图1A）。Western blot分析显示PINK1和Parkin蛋白水平显著降低。LC3-I丰度在各组间相当，而LC3-II表达增加，导致LC3-II/I比值升高。此外，我们观察到TFR1下调和铁蛋白表达上调（图1B）。COX8-EGFP-mCherry双荧光成像证实了线粒体自噬受阻……

**讨论**

本研究首次系统地体外证明神经球蛋白（NGB）通过调节m6A阅读器蛋白YTHDF3来对抗七氟醚对发育中神经元的损伤。本研究扩展了我们先前的动物研究[34]，并大大扩展了NGB介导的神经保护对抗七氟醚损伤的机制范围。我们早期的体内研究仅将NGB的保护作用归因于抑制神经元凋亡和增强HIF-1α表达，而未……

**CRediT作者贡献声明**

杨嘉鑫：撰写——审阅与编辑，撰写——原稿撰写，数据整理，概念化。刘金燕：方法论，调查。关蓉丽：撰写——审阅与编辑，撰写——原稿撰写，调查，形式分析。杨胜：资源，项目管理。李心怡：撰写——审阅与编辑，撰写——原稿撰写，项目管理，方法论。杨帆：撰写——审阅与编辑，撰写——原稿撰写，可视化，验证，经费获取。

**伦理声明**

本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准。（批准编号：2024PS219K）

**利益声明**

作者声明不存在利益冲突。

**伦理批准与同意参与**

所有动物实验均经中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准（编号：2024PS219K），所有方法均按照ARRIVE指南报告。

**同意发表**

不适用。

**数据与材料可用性**

支持本研究结果的数据可通过向通讯作者提出合理请求获得。

**经费来源**

本研究由辽宁省应用基础研究计划（项目编号2022JH2/101500068）和辽宁省教育厅科学研究项目（项目编号LJ212510164014）资助。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定及稿件撰写过程中均未参与。

**利益冲突声明**

? 作者声明，他们不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

**致谢**

我们感谢Editage（www.editage.cn）提供的英语语言编辑服务。

杨嘉鑫 | 关蓉丽 | 刘金燕 | 李心怡 | 杨胜 | 赵海 | 杨帆

中国医科大学附属盛京医院，沈阳，110004，中国