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摘要翻译：全面理解RNA动力学需要在活体系统中连续成像转录本的方法。研究人员近期开发了一组用于多重RNA检测的生物发光工具，由融合至RNA结合蛋白（RNA灯笼）的荧光素酶片段组成。RNA灯笼在结合独特的结构化RNA标签后组装出发光荧光素酶。通过生物发光共振能量
摘要翻译：全面理解RNA动力学需要在活体系统中连续成像转录本的方法。研究人员近期开发了一组用于多重RNA检测的生物发光工具，由融合至RNA结合蛋白（RNA灯笼）的荧光素酶片段组成。RNA灯笼在结合独特的结构化RNA标签后组装出发光荧光素酶。通过生物发光共振能量转移（BRET）至荧光蛋白融合体，产生不同颜色的发射光。在本工作中，研究人员系统优化了RNA灯笼平台以增强其在活细胞中的性能。研究人员鉴定出一种荧光素酶-荧光蛋白连接方式，能够改善能量转移并提高光子输出。RNA灯笼进一步经过优化，能够选择性识别结构化RNA标签。新的RNA灯笼-标签组合与现有探针正交，并实现了活细胞中三色生物发光RNA可视化的首次演示。总体而言，本工作扩展了用于实时、多重RNA成像的探针套件。
论文解读文章
**研究背景与问题**
RNA的时空动态行为对其功能调控至关重要，但长期以来缺乏能够在活体系统中连续、长期追踪RNA的技术。传统荧光成像方法依赖外源激发光，易引起光漂白、光毒性和背景荧光，限制了在生理环境中的应用。已有方法如CRISPR-based成像和荧光适配体虽取得进展，但在多重检测、信噪比和长期追踪方面仍存不足。研究人员此前开发了基于split-NanoLuc的“RNA灯笼”（RNA lantern）技术，将RNA结合蛋白（RBP）与NanoBiT片段融合，通过结合RNA标签触发荧光素酶互补和生物发光。然而，已有探针存在能量转移效率低、无RNA时背景信号高等问题，限制了低丰度RNA的检测和多色成像的分辨率。因此，亟需设计具有更高动态范围和更好光谱分辨率的优化RNA灯笼。
**研究内容与结论**
本研究旨在开发性能增强的RNA灯笼。关键设计改进是将荧光蛋白融合至NanoBiT的SmBiT片段（而非LgBiT），从而在RNA结合前避免过早的BRET，降低背景信号；RNA结合后，SmBiT-LgBiT互补形成功能性荧光素酶供体，BRET随目标RNA出现，产生颜色变化并提高能量转移效率。研究人员系统优化了荧光蛋白-SmBiT连接肽、RNA标签结构、活细胞表达系统，最终获得亮度最高、灵敏度最好的L7Ae-Nun RNA灯笼，并首次实现三色生物发光RNA成像。该工作发表于《ACS Chemical Biology》。
**主要技术方法**
研究人员利用HEK293T细胞裂解液和活细胞模型，采用以下关键技术：(1) 定点突变和基因融合构建多种连接肽的荧光蛋白-SmBiT融合体；(2) 体外转录合成不同间隔长度的结构化RNA标签，并评估其诱导灯笼组装的能力；(3) 稳定细胞系建立与共转染，结合超冷EMCCD相机进行生物发光和荧光成像；(4) 基于生物发光相量分析（bioluminescent phasor analysis）的多色光谱分离技术，用于同时分辨不同颜色的灯笼信号。样本来源为HEK293T细胞系。
**研究结果**
**1. 改进的RNA灯笼设计**
研究人员通过将荧光蛋白（VenusΔC12）融合至SmBiT，并采用L7Ae和Nun两种单体RNA结合蛋白，构建了新型RNA灯笼。相较于先前将荧光蛋白融合至LgBiT的构型，SmBiT融合设计在理论上可提高BRET效率并减少无RNA时的背景发射。分子建模支持该设计可行性。
**2. BRET效率优化**
通过筛选不同长度的连接肽（二肽AM、G4S、GGS、G4S×3等），发现两氨基酸（AM）和G4S连接肽的BRET效率最高（约0.84和0.83），显著高于先前LgBiT融合设计（约0.67）。G4S变体在亮度和BRET效率之间取得最佳平衡，因此被选为后续实验构型。将mScarlet-I融合至SmBiT也观察到有效能量转移，表明该策略具有通用性。
**3. RNA标签优化**
系统改变boxB和CS2适配体之间的间隔核苷酸数目（C-X-B），发现C-11-B标签（预测相位角约180°）产生最强的生物发光信号，相较于无RNA对照提升近1000倍，为迄今RNA灯笼中最高的信号增强。该结果与先前偏好紧凑标签的灯笼设计不同，可能由RBP结合位置和荧光蛋白体积导致。C-11-B标签表现出RNA浓度依赖性信号，且含有boxB点突变的对照RNA不产生信号，验证了结合特异性。L7Ae-Nun灯笼与现有MCP-PCP、MCP-Nun、MCP-L7Ae灯笼正交，无脱靶结合。
**4. 活细胞成像优化**
在HEK293T细胞中，初始共转染灯笼片段和靶RNA（RFP–C-11-B）时，无RNA对照组也出现较高背景互补。通过将核定位序列（NLS）融合至SmBiT片段，实现空间分离，显著降低背景并提升动态范围。进一步构建双顺反子质粒（IRES介导LgBiT表达），在保持信号的同时增大动态范围。稳定表达灯笼的细胞系转染不同量靶RNA后，最大信号增强约4.8倍。发射光谱显示，随着RNA表达增加，黄色（BRET）光子比例上升，验证了RNA依赖的颜色变化。单细胞成像清晰显示，表达靶RNA的细胞产生明亮生物发光，而对照细胞信号极弱。
**5. 三色RNA成像**
利用生物发光相量分析，将黄色L7Ae-Nun灯笼与蓝色、红色MCP-PCP灯笼组合，在共培养的HEK293T细胞中同时成像两种不同RNA标签（RFP–C-11-B和RFP–M-3-P）。通过相量坐标对每个像素进行伪彩色处理，三种颜色的灯笼细胞被清晰分辨，首次实现了三色生物发光RNA可视化。
**讨论与结论**
本研究的核心创新在于荧光蛋白-SmBiT融合策略，该策略不仅提高了新灯笼的BRET效率，也改善了已有RNA灯笼的性能。L7Ae-Nun灯笼作为第四个正交工具，可与现有探针任意组合使用。C-11-B标签和调控元件的优化使探针在裂解液和活细胞中均表现出迄今最强的RNA依赖性信号。三色成像的演示证明了该平台在多重RNA检测中的潜力。研究结论指出，该优化策略可推广至更多荧光蛋白和RBP/适配体对，进一步提升多重成像能力，为在活体系统中追踪RNA动力学提供了更强大的工具。
