马尿酸的计算机模拟与体外筛选揭示其在衰老中的潜在保护作用

《ACS Omega》：Exploring Hippuric Acid’s Putative Protective Role in Aging through In Silico and In Vitro Screening

　　

马尿酸（HA）是一种源自饮食和微生物组的代谢产物，一贯与健康衰老相关联，然而其究竟是被动生物标志物还是活性效应物仍悬而未决。为探究其保护作用背后的机制，研究人员对大型生物活性数据集进行了计算机模拟筛选，并将其与体外实验结果相整合。研究采用多指纹相似性方法鉴定与HA结构相似的类似物及其已报道的靶标。所识别的HA类似物对转运蛋白（溶质载体、有机阴离子转运蛋白、多药耐药相关蛋白）、表观遗传调控因子（组蛋白去乙酰化酶）以及与炎症、蛋白质稳态或血管稳态相关的酶（碳酸酐酶、环氧合酶-2、可溶性环氧化物水解酶、脑啡肽酶）具有低微摩尔或纳摩尔级别的报道效能。额外证据指向参与解毒、能量代谢和神经退行性变的蛋白质（犬尿氨酸酶、微管相关蛋白tau、2-氨基-3-羧基粘康酸-6-半醛脱羧酶），支持其作为候选HA靶标的合理性。相比之下，针对直接抗氧化或抗炎活性的数据库筛选大多无定论，而体外实验则提示HA具有有限的自由基清除活性，且不调节一氧化氮产生通路。结果表明，HA与衰老的保护性关联可能涉及对特定蛋白质或转运体介导机制的调节，而非仅通过非靶标特异性途径发挥作用。尽管这些发现仍属探索性研究，需要进一步确认，但这项集成的计算机模拟与体外分析提供了一种初步的、可产生假说的策略，以缩小潜在分子相互作用范围，并为未来的功能性计算机模拟、体外和体内验证实验提供候选靶标以作指导。

马尿酸（Hippuric Acid, HA）在衰老中潜在保护作用的计算机模拟与体外筛选研究解读

**一、研究背景与问题提出**

衰老是一个进行性的生物学过程，其特征是生理和认知功能丧失，以及对老年综合征易感性增加，最终降低老年人生活质量并增加死亡率。马尿酸（HA）是苯甲酸与甘氨酸的结合产物，由肠道微生物群对膳食多酚的分解代谢形成。流行病学研究表明，健康个体中HA水平随年龄增长而升高，但在衰弱、肌少症、风湿性疾病、活动受限和认知障碍等老年综合征中则有所降低。因此，HA被认为是与年龄相关功能衰退相关的一个有前景的标志物。然而，尽管流行病学和代谢组学研究提示HA可能反映了与健康衰老相关的饮食-微生物组相互作用，但其机制层面的数据仍然匮乏。目前证据尚不能阐明HA是否直接发挥生物学活性，抑或仅仅是有益多酚代谢的生物标志物。此外，尚未有系统性研究致力于识别HA可能作用的下游分子靶标，如受体、信号通路或酶。由于HA的体内外研究缺乏，非动物新方法（NAMs）为产生机制假说提供了高效且经济的手段，其中计算机模拟方法尤为适用于缺乏初步机制假说的研究阶段。本研究旨在通过集成的计算机模拟与体外策略，探索HA可能对年龄相关功能衰退发挥保护作用的推定机制。

**二、研究内容与意义**

研究人员对ChEMBL数据库进行了虚拟筛选，以识别HA的结构类似物及其已知生物学靶标，从而推断HA可能相互作用的潜在下游受体或酶。同时，研究人员还筛选了抗氧化数据库（AODB）、抗炎化合物数据库（AICD）和InflamNAT数据库，以探索HA可能无法通过直接蛋白质相互作用解释的有益活性，特别关注与老年综合征发病机制密切相关的抗氧化和抗炎特性。最终，研究人员通过体外实验测定HA的DPPH自由基清除能力和一氧化氮抑制活性，以验证计算机模拟筛选的结果。该研究发表在《ACS Omega》上，其意义在于提供了一种初步的、可产生假说的策略，为未来功能性验证实验提供候选靶标，并有助于评估HA作为饮食、肠道微生物群或药理学干预靶点的潜力。

**三、主要技术方法**

研究人员采用了多指纹（MFP）相似性筛选方法，利用11种正交分子指纹（FP）对ChEMBL v35、AODB、InflamNAT和AICD四个公共生物活性数据库进行筛选。该方法基于Tanimoto系数（TC）计算HA与数据库配体之间的结构相似性，并针对每种指纹建立了经验TC分布，以T5%阈值判定密切类似物。体外验证方面，研究人员使用QuantiChrom DPPH抗氧化能力检测试剂盒评估HA的抗氧化活性，并使用Griess试剂系统在脂多糖（LPS）刺激的RAW 264.7鼠巨噬细胞样细胞系（ATCC TIB-71）中评估HA的抗炎活性。

**四、研究结果**

*4.1 ChEMBL筛选*：通过MFP筛选，研究人员在ChEMBL数据集中鉴定出7个HA的密切类似物，包括HA本身、碘马尿酸、4-羟基马尿酸、3-羟基马尿酸、氨基马尿酸、倍他米隆和龙胆尿酸。这些类似物的报道活性显示其与表观遗传调控因子、溶质转运蛋白以及与炎症和血管功能相关的酶存在反复关联。具体而言，5个类似物显示出对SLC22转运蛋白家族的低微摩尔活性（K_m/IC₅₀ = 6.02–66 μM），抑制率高达约95%；多个类似物对有机阴离子转运蛋白（OAT）亚家族成员具有30–100%的抑制作用。组蛋白去乙酰化酶（HDAC）6被鉴定为类似物的靶标之一，抑制值为19.94–36.62%。此外，更广泛的蛋白质水平筛选将候选靶标范围缩小至一组有限的目标，包括HDAC（亚型6和8，pIC₅₀ = 5.4–6.4）、微管相关蛋白tau（MAPT）、碳酸酐酶（CA I/II，IC₅₀处于纳摩尔范围，pIC₅₀ = 6.6–7.07）、环氧合酶-2（COX-2）、脑啡肽酶和可溶性环氧化物水解酶（EPHX2/sEH）。

*4.2 计算机模拟评估HA的抗氧化和抗炎活性*：在AODB筛选中，5个HA类似物在所有11种正交指纹中TC均高于T5%，但这些类似物在抗氧化反应元件（ARE）信号通路激动剂测定和热量限制模拟物测定中均被一致分类为无活性。对各种机制类别的分析显示，HA类似物与无活性化合物的平均相似性普遍高于与活性化合物的相似性。DPPH测定中未发现结构相关类似物，最相似的化合物活性极低或可忽略。InflamNAT筛选仅检索到低相似度的类似物，其NO产生抑制IC₅₀值处于中微摩尔范围（55 μM和<50 μM），不能作为HA生物活性的可靠代理。AICD数据库中无化合物满足最严格相似性标准，但6个具有中度相似性的类似物对炎症相关酶（脑啡肽酶、COX-2、内皮素转换酶-1）显示出6–20 μM的IC₅₀或K_i值。

*4.3 HA抗氧化和抗炎活性的体外评估*：在0.15–50 μg/mL浓度范围内，HA的Trolox等价抗氧化能力（TEAC）值保持稳定，平均TEAC为80.28 ± 2.06 μM（CV = 2.56%），线性回归分析显示TEAC值与HA浓度对数之间无显著浓度依赖性关系（R² = 0.08，p = 0.156），表明HA具有极小的直接抗氧化活性。在LPS刺激的RAW 264.7细胞中，所有测试浓度的HA均未显著抑制亚硝酸盐产生，而阳性对照1400W则显著降低NO生成。HA处理不影响细胞活力，排除了细胞毒性作用对测定的干扰。

**五、讨论与结论**

研究人员将MFP筛选结果与SwissTargetPrediction和Polypharmacology Browser（PPB3）等独立预测工具进行了交叉验证，结果显示了良好的一致性。SLC22A6和CA I/II被独立鉴定为高概率靶标，其中SLC22A6作为HA已知底物被准确识别，验证了筛选方法的有效性。饮食干预研究表明，摄入富含多酚的食物后，HA血浆浓度可急剧升高至100 μM以上，达到足以触发候选靶标相互作用的水平。

综合计算机模拟与体外实验证据，HA的保护作用不太可能通过直接抗氧化或抗炎化学机制实现，而更可能涉及对特定蛋白质靶标的调节，特别是SLC/OAT转运蛋白家族、HDAC表观遗传调节因子，以及与炎症、解毒、线粒体代谢和血管稳态相关的酶。这些发现为HA作为健康衰老活性效应物的作用提供了假说生成框架，但需要进一步的分子对接模拟、靶向体外结合测定和功能性细胞实验来进行验证。

**研究结论**：本研究应用集成的计算机模拟与体外方法，结合多指纹相似性筛选和互补性实验测定，探讨了HA在衰老相关背景下的潜在保护机制。结果表明，HA不太可能通过直接抗氧化或抗炎化学作用发挥保护效应。相反，来自结构类似物和蛋白质水平优先级排序的趋同数据确定了内源性蛋白质和酶可作为HA的候选靶标，特别是转运蛋白（SLC/OAT）、表观遗传调节因子（HDAC）以及参与炎症、解毒、线粒体代谢和血管稳态的酶。虽然这些预测性发现不应被解释为HA实际分子靶标的确定性证据，但本研究作为更广泛探索策略的初步步骤，有助于缩小潜在靶标范围，为加速实验验证和指导定向测试提供了结构基础，以阐明HA是否真正发挥健康衰老活性效应物的功能。