牛血清白蛋白与槲皮素相互作用的季铵化壳聚糖增强：光物理、生物可及性与生物活性的多光谱研究

《ACS Omega》：Enhancement of the Interaction between Bovine Serum Albumin and Quercetin by Quaternary Ammonium Chitosan: Multispectroscopic Insights into Photophysics, Bioaccessibility, and Bioactivity

　　

槲皮素（Que）包封的牛血清白蛋白（BSA）纳米颗粒结合季铵化壳聚糖（HACC）被成功制备。研究人员通过傅里叶变换红外（FT-IR）光谱对纳米颗粒进行了表征，并使用扫描电子显微镜（SEM）检查了其形态。动态光散射（DLS）分析显示，Que-BSA-HACC纳米颗粒的尺寸范围为233至276 nm，包封效率高达62%。研究人员利用多光谱技术研究了HACC对BSA与Que相互作用的影响。HACC的引入增加了复合物的结合常数，表明结合亲和力增强。Que-BSA-HACC相互作用主要由疏水相互作用和静电相互作用驱动。此外，在模拟胃肠条件下，纳米颗粒表现出增强的槲皮素释放。与游离Que相比，纳米颗粒还表现出增强的抗氧化和抗炎活性，这归因于改善的水分散性。相比之下，针对SW-620细胞的细胞毒性研究表明，空白BSA-HACC纳米颗粒表现出相当的抗增殖效果，提示载体基质在观察到的活性中起主要作用。这些发现有助于开发新型类黄酮递送系统。

**BSA-HACC纳米递送系统增强槲皮素相互作用机制及生物活性的多光谱研究解读**

**一、 研究背景**

槲皮素（Quercetin, Que）是一种在水果、蔬菜和药用植物中含量丰富的多酚类黄酮化合物，因其具备抗氧化、抗炎、抗癌、心脏保护和神经保护等多种生物活性而备受关注。然而，Que的治疗应用受到其不利理化性质（尤其是水溶性差、口服生物利用度低、代谢迅速以及在生理条件下的化学不稳定性）的限制。基于纳米技术的递送系统应运而生，成为增强难溶性生物活性化合物疗效的有效策略。纳米颗粒可提供增大比表面积、增强溶解度与稳定性、延长循环时间和潜在靶向递送等优势。将Que封装于纳米颗粒中可保护其免受环境降解、改善全身吸收并实现可控释放。在各种纳米载体中，由于蛋白质-多糖杂化纳米颗粒具有优异的生物相容性、生物可降解性和结构多样性，相关研究兴趣日益增加。牛血清白蛋白（Bovine serum albumin, BSA）是广泛使用的模型蛋白载体，其与人血清白蛋白（Human serum albumin, HSA）具有约76%的序列同源性，所观察到的相互作用趋势可为基于HSA的递送系统提供参考。然而，尽管已有基于BSA和壳聚糖的槲皮素递送系统报道，季铵化壳聚糖（2-hydroxypropyltrimethylammonium chloride chitosan, HACC）对BSA与槲皮素分子间相互作用的调控机制及其对纳米颗粒形成和性能的贡献仍不清楚。因此，本研究旨在开发用于槲皮素递送的BSA-HACC纳米颗粒，并通过光谱技术阐明HACC在调节BSA与槲皮素相互作用中的作用。

**二、 研究内容概述与结论**

研究人员成功制备了Que-BSA-HACC纳米颗粒，粒径范围为233-276 nm，包封效率高达62%。多光谱分析表明，HACC的引入通过疏水相互作用和静电相互作用增强了BSA与Que之间的结合亲和力。纳米颗粒在模拟胃肠液中表现出增强的药物释放行为，以及较游离Que更优的抗氧化和抗炎活性，这主要归因于水分散性的改善。然而，针对SW-620结肠癌细胞的细胞毒性研究表明，空白BSA-HACC载体本身即具有相当的抗增殖效应，提示载体基质在生物活性中发挥主要作用。研究为类黄酮-蛋白质-多糖复合物的相互作用机制提供了新见解，并展示了BSA-HACC纳米颗粒作为改善疏水性生物活性化合物分散性和生物可及性平台的潜力。该成果发表于《ACS Omega》。

**三、 主要技术方法概述**

研究人员首先在磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4）中，通过静电相互作用将Que与BSA结合形成复合物，再加入阳离子聚合物HACC和交联剂三聚磷酸钠（TPP）组装形成纳米颗粒。表征技术包括：利用动态光散射（DLS）测定粒径、多分散指数（PDI）和ζ电位；采用傅里叶变换红外（FT-IR）光谱分析化学基团与分子间作用力；借助扫描电子显微镜（SEM）观察形态。机制的阐明主要依赖紫外-可见（UV-vis）吸收光谱、稳态荧光光谱、同步荧光光谱、圆二色（CD）光谱及基于Stern-Volmer方程、双对数方程和Van't Hoff方程计算结合参数（K_sv, K_a, n）与热力学参数（ΔH, ΔS, ΔG）。此外，通过UV-vis光谱测定包封效率（EE），透析袋法评估模拟胃肠液（SGF/SIF）中的释放行为。生物活性评估采用了DPPH自由基清除实验、HaCaT细胞WST-1实验与酶联免疫吸附测定（ELISA）评估抗炎活性，以及SW-620细胞MTT实验评估抗癌活性。样本队列来源包括商业购买的BSA（Thermo Fisher Scientific）、HACC（泰国Chanjao Longevity有限公司）、Que（东京TCI公司），以及由国家纳米技术中心（NANOTEC，泰国）提供的SW-620细胞系。

**四、 研究结果**

*3.1 BSA对Que吸收和发射的影响*：通过UV-vis和荧光光谱发现，随BSA浓度增加，Que在370 nm处吸收峰逐渐降低并在425 nm处出现新吸收峰，等吸收点在399 nm，证实了Que-BSA复合物的形成。荧光光谱显示，BSA增强了Que在531 nm处的发射峰强度并红移至537 nm，该变化归因于BSA干扰了Que分子内5-OH与C=O的氢键，从而促进了激发态分子内质子转移（ESIPT）互变异构体的稳定化，表明二者存在强结合作用。

*3.2 HACC对Que吸收和发射的影响*：UV-vis光谱显示Que与HACC直接作用时在450 nm处产生新吸收峰，提示形成Que-HACC复合物。荧光Stern-Volmer分析显示，无BSA时，HACC对Que的猝灭常数K_sv为1.33 ×10⁵ M^–1，高于有BSA时的0.46 ×10⁵ M^–1。该结果表明大部分Que优先与BSA结合形成复合物，HACC随后通过离子作用与BSA-Que复合物结合，从而降低了对Que的直接猝灭效率。

*3.3 结合和热力学参数分析*：通过不同温度（298-338 K）下的荧光猝灭实验，Stern-Volmer图的斜率随温度升高而降低，表明BSA与Que的猝灭机制为静态猝灭，且HACC不改变该机制。结合常数K_a在所有温度下均遵循BSA-Que < BSA-Que-HACC 0.01% < BSA-Que-HACC 0.1%的顺序，说明HACC显著增强了BSA与Que的结合亲和力。K_a随温度升高而增大，表明结合过程为吸热反应。结合位点数n值约为1，指征1:1结合。热力学参数显示ΔG为负值（-9.62至-19.31 kJ·M^–1），表明结合过程自发进行；ΔH和ΔS均为正值（如BSA-Que-HACC 0.1%时ΔH为20.57 kJ·M^–1），提示疏水相互作用是主要驱动力。

*3.4 同步荧光和圆二色光谱*：同步荧光光谱分析显示，Que的加入导致BSA中色氨酸（Trp）残基（Δλ=60 nm）λ_max红移，表明其微环境极性增加；HACC的加入则导致Trpλ_max轻度蓝移和酪氨酸（Tyr）残基（Δλ=15 nm）红移，但单独的HACC不引起BSA同步荧光光谱位移，说明HACC不与BSA的主要疏水结合位点直接作用。圆二色（CD）光谱表明HACC使BSA α-螺旋含量降低、无规卷曲含量增加，说明蛋白部分解折叠；Que的加入则增加了α-螺旋和无规卷曲含量，有稳定蛋白结构的作用。

*3.5 纳米颗粒表征和包封率*：SEM图像显示纳米颗粒呈球形，平均直径为219±21.80 nm，与DLS结果一致。FT-IR光谱显示，纳米颗粒形成后BSA的酰胺I带从1637 cm^–1移至1652 cm^–1，酰胺II带从1527 cm^–1移至1534 cm^–1，证实了静电和疏水作用驱动的结构修饰。DLS分析显示，纳米颗粒粒径随Que浓度升高而降低，BSA和HACC浓度对粒径影响不显著，但PDI值在0.4-0.8间，表明粒径分布不均。ζ电位在+9至-10 mV之间，呈近中性表面电荷，表明体系以空间位阻稳定为主。包封效率随BSA浓度升高由约10%增至60%，最大约62%，Que浓度增加使EE降低，HACC浓度对EE无显著影响。

*3.6 在SGF和SIF中的释放*：透析袋法研究显示，与游离Que相比，Que-BSA-HACC纳米颗粒在模拟胃液（SGF）和模拟肠液（SIF）中均表现出增强的槲皮素释放。纳米颗粒在模拟胃肠条件下粒径从323 nm增至SGF中的325 nm和SIF中的382 nm，而PDI和ζ电位基本不变，提示基质溶胀但保持了结构完整性。

*3.7 生物活性*：

*3.7.1 DPPH自由基清除活性*：在相同浓度条件下，Que-BSA-HACC纳米颗粒较游离Que表现出更高的表观DPPH自由基清除活性，该增强主要归因于纳米封装显著改善了Que在水性介质中的分散性。

*3.7.2 抗炎活性*：基于WST-1细胞毒性结果，选取0.15 μg/mL Que浓度进行抗炎实验。在UVA/UVB辐射诱导的HaCaT细胞炎症模型中，游离Que和Que-BSA-HACC纳米颗粒均有效降低了促炎细胞因子（TNF-α、IL-6、PGE2）水平并增强了抗炎细胞因子IL-10分泌，而空白BSA-HACC纳米颗粒无此效果，确认了抗炎活性主要归因于Que。

*3.7.3 抗癌活性*：MTT实验结果显示，QueNPs对SW-620细胞的IC₅₀值为94.0±4.7 μg/mL，空白BSA-HACC纳米颗粒的IC₅₀值为90.0±9.4 μg/mL，两者相当，且均低于游离Que（134.8±23.7 μg/mL）。这表明空白载体本身即具有显著的抗增殖作用，其机制可能与HACC的正电荷与癌细胞膜负电荷的静电相互作用、以及BSA介导的受体介导内吞作用有关，因此观察到的细胞毒性不能单独归因于Que的包封。

**五、 讨论与结论**

研究通过多光谱和热力学分析证实HACC能增强BSA与Que的结合亲和力，主要驱动力为疏水作用和静电作用。但需注意，这些相互作用机制基于间接光谱证据，尚需通过位点竞争实验、荧光寿命、等温滴定量热法（ITC）、分子对接等手段进行分子水平验证。研究还显示BSA-HACC递送系统赋予了Que增强的抗氧化、抗炎活性和模拟胃肠液中的缓释行为，然而抗癌研究表明载体本身对抗增殖效应贡献显著。结论部分指出，本研究成功开发了基于BSA和HACC的新型药物递送系统用于Que封装，纳米颗粒平均粒径约233 nm，EE最高达62%。该系统提供强抗氧化活性、增强Que的抗炎功效以及模拟胃肠条件下的持续释放。然而，由于空白载体表现出与载药纳米颗粒相当的细胞毒性，观察到的增强抗增殖效应不能单纯归因于Que包封。虽然体外研究显示了增强的抗氧化和抗炎活性，仍需在合适的动物模型中进一步验证其体内生物学性能。本研究的局限性在于较高的PDI值和储存期间粒径的逐渐增大，提示有限的长效胶体稳定性，需要进一步优化处方，以评估在制药和食品相关系统中的实际应用。总之，本研究为类黄酮-蛋白质-多糖复合物的相互作用提供了新见解，展示了BSA-HACC纳米颗粒作为改善疏水性生物活性化合物分散性和生物可及性平台的潜力。