氰烯酮与烯酮融合的4-雄烯-3,17-二酮衍生物的合成及针对三阴性乳腺癌的生物学评价

《Bioorganic Chemistry》：Synthesis and biological evaluation of cyanoenone- and enone-fused 4-androstene-3,17-dione derivatives against triple-negative breast cancer

　　

摘要

合成了一系列经过氰烯酮和烯酮修饰的4-雄烯-3,17-二酮（4-AD）类似物，并评估了它们对三阴性乳腺癌（TNBC）细胞的抗增殖活性。其中，化合物48（SH458）表现出最强的抗增殖活性，其对多种TNBC细胞系的IC₅₀值在0.14至0.28 μM之间。机制研究表明，SH458通过诱导细胞凋亡和细胞周期停滞来抑制TNBC细胞的增殖。此外，SH458显著上调了未折叠蛋白反应（UPR）相关基因的表达，包括ATF4、ATF6、PERK、CHOP、IRE1、XBP1、GRP78、GADD34、PBGD和ERdj4/DNAJB9，以及UPR相关蛋白，如eIF2α、p-eIF2α、IRE1α和p-IRE1α，这种上调具有时间和剂量依赖性。这些结果表明SH458能持续引发ER应激并激活UPR通路，最终导致TNBC细胞死亡。在体内实验中，SH458显著抑制了TNBC肿瘤生长，其效果优于多柔比星，且没有引起明显的毒性。因此，SH458可能成为开发针对TNBC的新药的有希望的候选化合物。

引言

目前，乳腺癌是女性中最常见的癌症类型，也是全球女性癌症相关死亡的主要原因[1]。三阴性乳腺癌（TNBC）的特点是缺乏雌激素受体（ER）和孕酮受体（PR）的表达，同时human epidermal growth factor receptor 2（HER2）也未过度表达或发生基因扩增[2],[3]。它是恶性程度最高的乳腺癌类型，预后较差，转移潜力高，复发早，约占所有乳腺癌病例的15–20%[4],[5],[6]。由于缺乏ER、PR和HER2的表达，TNBC不适合内分泌治疗或HER2靶向治疗。因此，细胞毒性化疗一直是TNBC治疗的主要手段，常用的药物包括多柔比星、紫杉醇、卡铂、环磷酰胺、5-FU和卡培他滨[7],[8],[9]。然而，化疗药物常常受到全身毒性的限制，并且在临床治疗中容易产生耐药性[10],[11]。因此，迫切需要发现具有独特作用机制的新治疗药物来治疗TNBC。

2-氰-3,12-二氧oleana-1,9(11)-二烯-28-酸（CDDO）及其衍生物（图1）是合成三萜类化合物，据报道能够抑制多种类型的肿瘤生长，包括乳腺癌、肝细胞癌和肺癌[12],[13],[14]。值得注意的是，CDDO及其衍生物具有抗TNBC活性。例如，Deng等人报告称CDDO通过抑制TRIP13/STAT3信号通路在体外和体内均能抑制TNBC的生长[15]；Suh等人也报告称CDDO-咪唑烷通过调节癌症干细胞相关信号通路抑制TNBC肿瘤球的形成[16]；Jiao等人发现CDDO-甲基酯可以促进EGFR的降解并减缓TNBC的进展[17]。结构-活性关系研究表明，A环的氰烯酮和C环的烯酮结构是CDDO高生物活性的关键成分[18],[19],[20]。因此，将氰烯酮和烯酮结构结合到骨架中可能是发现新的抗TNBC药物的有效策略。

甾体化合物在药物发现中被认为是理想的骨架，因为它们具有刚性的多环结构、丰富的结构多样性和广泛的生物活性[21]。自20世纪50年代甾体药物研究和开发以来，已有超过400种基于甾体的药物被开发出来用于治疗各种疾病[22],[23]。在寻找针对TNBC的新化学物质的过程中，一些甾体化合物被证实具有抗TNBC活性。例如，如图1所示，米非司酮及其衍生物FZU-00003通过诱导miR-153来抑制KLF5表达，从而抑制TNBC细胞的生长[24]；氟维酮是一种选择性的雌激素受体降解剂，通过上调雌激素受体β来抑制雌激素受体β阳性的TNBC细胞的生长[25]；阿比特龙乙酸酯是一种雄激素合成抑制剂，在二期试验中对部分雄激素受体阳性的TNBC患者显示出临床疗效[26],[27]。因此，将氰烯酮和烯酮结构引入甾体化合物中可能是开发抗TNBC药物的有希望的策略。在这里，我们首次报告在我们的内部小分子甾体化合物库筛选中发现4-雄烯-3,17-二酮（4-AD；图1和表1）是一种对TNBC细胞线具有中等活性的化合物，其IC₅₀值为59.38 μM。4-AD可以通过工业菌株 NRRL B-3805对植物甾醇进行侧链降解来生产[28],[29]。目前4-AD的售价相对较低，使其成为开发抗TNBC药物的实用且有吸引力的起始材料。考虑到氰烯酮和烯酮结构的有效性，我们合成了包含这两种结构的4-AD衍生物，评估了它们在TNBC细胞中的抗增殖效应，并进行了结构-活性关系（SAR）分析。结果表明，化合物48（SH458）对TNBC细胞增殖的抑制效果最显著。此外，还研究了SH458的作用机制，并在皮下MDA-MB-231异种移植物模型中评估了其抗TNBC效果。

章节摘要

化学

基于我们之前的工作[30]，合成了一系列含有烯酮官能团（氰烯酮和烯酮）的4-雄烯-3,17-二酮（4-AD）衍生物。合成路线分别见方案1、方案2、方案3和方案4。

4-AD衍生物9–11和13的合成方法如方案1所示。化合物1是通过在

-甲苯磺酸（

-TsOH）存在下使用三甲基正甲酸酯对4-AD进行烯醇醚化反应制得的。随后用硼氢化钠还原化合物1

生物评估

使用硫罗丹明B（SRB）测定法评估了合成的4-AD衍生物9–11、13、24、26–51、53–58和61对人类TNBC细胞系MDA-MB-231的体外抗增殖活性。CDDO和多柔比星作为阳性对照。结果显示，所有合成衍生物对MDA-MB-231细胞的抑制作用都显著增强，优于初始发现的化合物4-AD。表现出强活性的化合物包括32–35、37–40和47–49

结构优化和SAR探索

首先，我们从内部小分子甾体化合物库中筛选出4-AD作为一种中等活性的化合物（IC₅₀ = 59.38 μM），针对TNBC细胞系MDA-MB-231。第一轮合成的4-AD衍生物（9–11、13、24、26和27），在A/B环或C环上含有氰烯酮和烯酮结构，使用SRB测定法评估了它们对MDA-MB-231细胞的抗增殖活性（表1）。结果显示这些4-AD衍生物表现出

结论

概述

所有试剂和化学品均从商业供应商处购买，除非另有说明，否则未经进一步纯化直接使用。必要时，反应在正压干燥的N₂环境中进行于烤箱干燥的玻璃器皿中完成。柱层析使用QinDao牌200–300目硅胶（QinDao）和指定的洗脱剂进行。薄层层析在QinDao牌硅胶板上进行，层厚度为0.25 mm。熔点使用MEL?TEMP 3.0仪器测定

CRediT作者贡献声明

Jing-Zan Zhang：撰写初稿、方法学设计、实验实施、数据整理。Yunxuan Li：撰写初稿、方法学设计、实验实施、数据整理。Jin-Hui Huang：撰写初稿、方法学设计、实验实施、数据整理。Min Wu：撰写初稿、实验实施、数据整理。Qiaobing Yue：撰写初稿、实验实施、数据整理。Mingyao Liu：数据整理、概念构思。Chen-Chen Li：项目监督、行政管理、数据整理

伦理声明

本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究已获得华东师范大学实验动物福利与伦理委员会的批准。

作者声明以下可能的利益冲突/个人关系：Chen-Chen Li、Zheng-fang Yi和Wen-Wei Qiu的研究得到了国家自然科学基金的支持。

本工作得到了国家自然科学基金（编号82373146）、上海长宁妇幼保健医院联合PI项目（编号PI202430）和长宁区卫生系统（PI）研究团队项目的资助。

Jing-Zan Zhang|Yunxuan Li|Jin-Hui Huang|Min Wu|Qiaobing Yue|Mingyao Liu|Chen-Chen Li|Zhengfang Yi|Wen-Wei Qiu

华东师范大学化学与分子工程学院分子治疗和新药开发上海工程技术研究中心，中国上海200062