《Bioresource Technology》：Key enzyme optimization and multi-node metabolic flux regulation drive
l-arginine production in
Escherichia coli
编辑推荐：
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构建了一种无质粒、非依赖营养的E. coli菌株，用于过表达l-精氨酸。
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OAT变体Y
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构建了一种无质粒、非依赖营养的E. coli菌株，用于过表达l-精氨酸。
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OAT变体Y386Q的催化效率相比野生型提高了2倍。
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ASS的Y332L变体被新地与精氨琥珀酸裂解酶融合。
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sRNA引导的多节点工程将碳流重定向到l-精氨酸途径。
- • 在5升生物反应器中，获得了125.6克的l-精氨酸，产率为0.53克/克葡萄糖。
引言
l-精氨酸是一种半必需氨基酸，具有重要的生理功能，广泛应用于营养补充剂和药物合成领域，市场需求持续增长。为了解决传统蛋白水解和化学合成方法在可持续性和经济性方面的挑战，高效微生物发酵生产l-精氨酸已成为工业生物技术的重点。构建高性能的微生物细胞工厂是将可再生资源有效转化为目标产品（如l-精氨酸）的核心任务。
大肠杆菌由于其明确的遗传背景、易于操作和快速生长特性，已成为构建l-精氨酸微生物细胞工厂的经典底盘。已实现132克/升的l-精氨酸产量，产率为0.51克/克葡萄糖（Jiang等人，2023年）。关键策略包括：(1)引入谷氨酸衍生的鸟氨酸乙酰转移酶，将线性的l-精氨酸合成途径转化为循环途径；(2)敲除转录抑制因子ArgR并上调l-精氨酸合成基因簇（Cho等人，2015年）；(3)增强NADPH和ATP的供应（Xu等人，2018年）；(4)强化氨基甲酰磷酸合成酶。最近，开发了一种响应谷氨酰胺的双向调控系统（ONGNRs），可以感知细胞内的l-谷氨酰胺并调节氨的同化流，从而提高l-精氨酸的水平至120.68克/升（Wang等人，2026年）。
所有上述策略都需要充足的碳骨架和前体供应。然而，针对上游糖吸收途径的改良在现有研究中仍相对较少。考虑到L-精氨酸漫长的生物合成途径和复杂的分支代谢，这一关键步骤的深度优化不容忽视。除了普遍的提高碳吸收的策略外，精准调控l-精氨酸合成途径中的关键酶也成为另一种重要方法。例如，引入带有H15Y和K204T突变的l-精氨酸的产量（Ginesy等人，2015年；Sheng等人，2026年）。将中，使l-精氨酸产量提高了6.7倍（Jiang等人，2023年）；而从基因后，产量进一步提高至41.89克/升（Sheng等人，2026年）。修改调控和降解系统，如ArgRY33X突变以减弱ArgR抑制器的功能，以及PyrGD450H和SpeBE189A突变以减少旁路降解途径的活性，也被证明能有效提高l-精氨酸的产量（Sheng等人，2026年）。然而，位于循环途径和线性途径交汇处的两个关键酶——鸟氨酸乙酰转移酶（OAT）和精氨琥珀酸裂解酶（ASS）仍然需要系统的工程改造。
除了关键酶工程外，充足的氮供体中间体（l-天冬氨酸和l-谷氨酰胺）的供应也是高效生产l-精氨酸的另一个主要限制因素。多种途径之间的不平衡往往会导致中间体积累或副产物偏移，因此需要精确的代谢流控制。最近，基于sRNA的动态调控技术使得关键代谢节点的快速识别和微调成为可能（Chen等人，2025年）。调整这些节点的表达水平可以精确地重新分配代谢流。表S1提供了与近期报道的高产菌株的定量比较。值得注意的是，我们的工作通过多级工程开发了一种无质粒、无需诱导剂的菌株，既具有优越的工业适用性，又保持了竞争力。
在本研究中，使用了我们实验室先前构建的一种生产l-精氨酸的E. coli菌株（Gao等人，2026年），并将其命名为G0菌株。该底盘具有改进的TCA循环途径和从l-谷氨酸到l-精氨酸的合成途径。首先增强了碳吸收模块，以提高葡萄糖的利用效率，并缩短了滞后期和对数期的发酵时间。随后筛选并改造了两个关键酶OAT和ASS，以实现l-精氨酸的过量表达，同时减少中间体的积累。最后，在sRNA的引导下，我们确定了l-精氨酸生物合成途径中的关键节点，并精细调节了代谢流。这些策略帮助构建了一种高效生产l-精氨酸的菌株，该菌株不含质粒、诱导剂和营养缺陷。本研究通过多级工程策略系统地重构了E. coli中的l-精氨酸合成途径，包括碳途径的改进、关键酶的定向进化以及全局代谢流的动态调控，为l-精氨酸和其他氨基酸的工业生产提供了宝贵见解。
章节片段
菌株、质粒和基因组操作
菌株和质粒的详细信息见表S2。本研究使用了pCas9和pTarget质粒进行CRISPR/Cas9介导的基因编辑。用于基因组操作的引物列在表S3中。
培养基和条件
E. coli细胞在37°C下培养于LB液体培养基或LB琼脂平板上，根据需要加入适量的抗生素（如卡那霉素50微克/毫升和壮观霉素50微克/毫升）。IPTG的最终添加浓度为0.2毫摩尔/升。
增强葡萄糖代谢和谷氨酸/天冬氨酸吸收以提高l-精氨酸产量
我们在实验室构建的l-精氨酸生产菌株G0（Gao等人，2026年）在摇瓶培养中通过强化从乙酰辅酶A到l-精氨酸的生物合成途径实现了12.3克/升的产量。为了进一步提高l-精氨酸的产量，我们系统优化了G0菌株的葡萄糖代谢模块，以提高葡萄糖的利用率，加速早期生长并延长生产期。通过分别过表达一系列关键代谢基因
结论
本研究通过多级工程策略成功构建了一种高效生产l-精氨酸的菌株。首先筛选并增强了糖吸收途径以促进l-精氨酸的合成。随后，通过对鸟氨酸乙酰转移酶进行半理性修饰（引入酰胺基团以稳定乙酰酶中间体的氧阴离子过渡态），并对精氨琥珀酸裂解酶进行工程改造以优化底物/产物的可及性
CRediT作者贡献声明
高欣：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，可视化，验证，方法学，研究，数据分析，概念化。 吴安仪：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，方法学，数据分析。 杨志腾：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，数据分析。 陈瑶：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，数据分析。 王普：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，数据分析。
资助
本研究得到了国家重点研发计划（2022YFA0911800）和浙江省重点研发计划（2024C03012）的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
研究的构思与设计：高欣、周军； 实验执行：高欣、吴安仪、陈瑶； 数据分析与手稿撰写：高欣、周军、杨志腾、王鹏、黄亮、陈瑶； 监督、项目管理和资金获取：周军、刘志、郑宇。
高欣 | 吴安仪 | 杨志腾 | 陈瑶 | 王普 | 黄亮刚 | 周俊平 | 刘志强 | 郑宇国
