利用CRISPR-Cas12a编辑肺炎克雷伯菌高效生产1,3-丙二醇，以甘油和木质纤维素水解液作为共底物

《Bioresource Technology》：Highly efficient production of 1,3-propanediol by CRISPR-Cas12a-edited Klebsiella pneumoniae using glycerol and lignocellulosic hydrolysate as co-substrates

　　

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  为肺炎克雷伯菌开发了高效的 CRISPR-Cas12a 基因组编辑工具。
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  糖 - 甘油共代谢通过缓解碳竞争提高了 1,3-PDO 的产量。
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  利用木质纤维素水解液和甘油高效生产 1,3-PDO。

Introduction

1,3-丙二醇（1,3-PDO）是一种重要的生物基化学品，广泛用于聚酯材料的生产，特别是聚对苯二甲酸丙二醇酯（PTT），以及医药和化妆品行业（Lee et al., 2025, Teng et al., 2025）。随着市场需求的持续增长，开发高效且具成本效益的 1,3-PDO 生物合成技术已成为全球研究的关键焦点（Zhang et al., 2026）。甘油是生物柴油产业的主要副产品，供应丰富且成本低廉。通过生物途径将甘油转化为 1,3-PDO 具有显著的环境和经济利益，已成为甘油高值化利用的核心途径（Agrawal et al., 2023）。此外，木质纤维素水解液是一种丰富的可再生碳源，可替代传统的食品级发酵底物。这种替代不仅降低了发酵成本，还缓解了当前能源和环境问题的压力（Fu et al., 2022, Teng et al., 2025, Van et al., 2023a, Van et al., 2023b）。它为 1,3-PDO 的可持续生产提供了替代底物，其逐步或集成转化途径可调整以满足各种工业应用要求。

肺炎克雷伯菌作为一种兼性厌氧革兰氏阴性菌，天然具有高产 1,3-PDO 的能力，被广泛认为是该领域有前景的生产宿主。在厌氧条件下，甘油通过甘油脱水酶（GDHt）和 1,3-丙二醇氧化还原酶（PDOR）转化为 1,3-PDO，这两种酶均由 dha 操纵子编码（Zhu et al., 2022）。然而，这种天然代谢途径存在大量的碳通量分流：氧化支路产生大量副产物，包括乙醇、乳酸、乙酸、琥珀酸和 2,3-丁二醇。这些副产物消耗甘油衍生的碳，降低目标产物的产量，增加下游处理的复杂性，并最终限制该菌株的工业应用（Chen et al., 2024, Zabed et al., 2023）。因此，系统地通过代谢工程调控碳通量分布对于实现高效的 1,3-PDO 合成至关重要。此外，以甘油为唯一碳源的发酵过程往往受到还原力不足以及生物量形成与产品合成之间代谢竞争的限制，这阻碍了最终产物滴度的进一步提高（Wang et al., 2026）。大多数代谢工程研究专注于单个通路的删除或过表达，对于甘油还原支路和氧化支路之间碳通量协调调节、辅因子再生机制以及多碳源协同利用的代谢基础刻画不足（Kongjan et al., 2021, Sun et al., 2025）。

高效且稳定的基因编辑工具对于代谢工程至关重要（Hao et al., 2024）。近年来，CRISPR-Cas 基因组编辑技术因其成本低、操作简便、效率高且适用性广而在微生物合成生物学和代谢工程中得到广泛应用（Lim and Lee, 2024, Shi et al., 2022, Van et al., 2023a, Van et al., 2023b）。包括传统的 CRISPR-Cas9 系统和最近开发的 CRISPR-Cas12f1 系统在内的多种基于 CRISPR 的基因组编辑平台已在肺炎克雷伯菌中成功建立（Wang et al., 2018, Wu et al., 2021）。不同的 CRISPR 核酸酶具有不同的靶向特性和间隔序列邻近基序（PAM）要求，因此开发替代的 CRISPR 系统可以为特定菌株的基因组工程提供互补选择。CRISPR-Cas12a (Cpf1) 系统属于 V 型 CRISPR 系统。在该系统中，单个 crRNA 引导 DNA 切割产生黏性末端，这使其在多重基因组编辑方面具有独特优势（Ling et al., 2021, Yan et al., 2017）。源自 Francisella novicida 的 FnCas12a 变体具有固有的 RNase 活性，能够直接从前体转录本加工 crRNA。这一特征大大简化了多个向导 RNA (gRNA) 的设计和表达（Liu et al., 2022a, Liu et al., 2022b, Shen et al., 2019）。然而，目前 CRISPR-Cas12a 在肺炎克雷伯菌中的应用主要集中在病原体检测，关于其在代谢工程中的利用报告有限（Tan et al., 2024, Wei et al., 2026）。

为了解决这些局限性，我们在肺炎克雷伯菌 S2 中建立并优化了基于 CRISPR-Cas12a 的高效基因组编辑平台，为后续精确的基因操作奠定了技术基础。利用该平台，我们系统删除了竞争代谢途径中的关键基因（frdA, poxB, adhE, ldhA, glpK, ptsG, 和 dhaM），以将碳通量重新定向至 1,3-PDO 生物合成途径。此外，我们通过引入外源甘油合成模块，重建了耦联的“葡萄糖 - 甘油 -1,3-PDO"代谢网络。最后，我们研究了不同糖类对甘油共代谢的影响，以构建多碳源协同代谢系统。我们进一步使用玉米芯木质纤维素水解液（一种工业相关原料）验证了工程菌株的性能，以提高甘油发酵产出。本工作为 1,3-PDO 的可持续、高效且经济可行的工业生产提供了理论见解和技术支持。

Section snippets

菌株与质粒

Escherichia coli DH5α，购自上海 Sangon Biotech Co., Ltd.，用作 DNA 操作的标准克隆宿主。K. pneumoniae S2（K. pneumoniae 菌株 DSM 2026 的突变体），储存于我们实验室，用作代谢工程和发酵实验的宿主菌株。所有涉及 K. pneumoniae S2 的实验均在生物安全二级（BSL-2）条件下进行。

培养基与培养条件

拉乌林 - 伯格蒂培养基（LB 培养基）含有 NaCl 10 g/L，蛋白胨 10 g/L，以及酵母提取物

肺炎克雷伯菌 S2 中的异源 CRISPR-Cas12a 基因编辑系统

源自 F. novicida 的 Cas12a 系统被异源引入肺炎克雷伯菌 S2，以构建一个高效的基因编辑平台。鉴于肺炎克雷伯菌 S2 具有多重耐药性，我们优化了抗生素选择强度 và 诱导剂浓度，以最大限度地减少代谢负担并降低假阳性率，同时保持足够的表达水平。我们评估了靶向 frdA 基因的编辑效率，以比较单质粒系统的性能

结论

开发了一种基于 CRISPR-Cas12a 的肺炎克雷伯菌高效基因组编辑平台，能够实现单基因（100% 效率）和双基因（75% 效率）的精确修饰。该平台为复杂代谢网络的理性重构提供了稳健的技术框架。通过系统删除与竞争碳通量和还原力消耗途径相关的基因，并将此编辑与外源甘油合成模块的表达相结合，

CRediT 作者贡献声明

Li Wang: 数据整理，写作 – 初稿，调查，形式分析，写作 – 审阅与编辑。Mingyang Zhao: 数据整理，写作 – 初稿。Yuanming Ye: 数据整理，写作 – 初稿。Cai Feng: 数据整理，调查。Yaqin Sun: 方法论，调查。Zhiwei Zhu: 方法论，写作 – 审阅与编辑。Shihui Yang: 方法论，写作 – 审阅与编辑。Zhihong Xiu: 概念化，资金获取，写作 – 审阅与编辑。

伦理批准与参与同意

不适用

出版同意

不适用。

资金

本工作由中国国家重点研发计划（2022YFA0911802）支持。

未引用参考文献

Chen et al. (2003)。

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这可能影响本文报告的工作。

致谢

我们感谢上海交通大学生命科学与技术学院白凤武教授提供玉米芯水解液，以及中国科学院深圳先进技术研究院沈俊涛博士提供质粒 pMTL83151、p15a-AsCas12f-apmR 和 psgRNAv1-empty-1。

Li Wang|Mingyang Zhao|Yuanming Ye|Cai Feng|Yaqin Sun|Zhiwei Zhu|Shihui Yang|Zhihong Xiu