综述：邻近标记技术：绘制蛋白质相互作用图谱的强大工具

《Biosensors and Bioelectronics》：Proximity Labeling: A Powerful Tool for Mapping Protein Interactions

　　

摘要

蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）对细胞调控至关重要，其失调会导致多种疾病。传统的PPI研究方法往往缺乏足够的空间和时间分辨率，且在捕捉弱相互作用、短暂相互作用或依赖环境的分子关联方面存在局限性。邻近标记（PL）技术通过使用针对特定蛋白质、亚细胞区室、膜或其他生物位置的标记酶或光催化剂来生成反应性中间体，从而在活体系统中共价标记附近的生物分子，提供了对蛋白质邻域和分子邻近关系的无偏视图。本文总结了基于酶的、分割酶的以及光催化邻近标记（PPL）平台的最新进展。我们讨论了整个酶系统，重点介绍了它们的工程优化以及在动态相互作用组映射、细胞器组织和信号调节中的应用。分割酶策略作为一种条件性标记方法，提高了研究可诱导相互作用和膜接触位点的空间特异性。此外，还介绍了基于金属复合物、有机发色团和基因编码光催化剂的新兴PPL平台，这些平台具有光控激活特性，并在基因无法访问的系统中具有更广泛的应用前景。最后，我们比较了不同PL技术的优势、局限性及其适用范围，并讨论了未来的挑战，包括提高生物相容性、扩展组织应用以及将PL与先进的组学和计算方法相结合。

引言

蛋白质是细胞功能的核心调节因子，通过与多种生物分子（包括其他蛋白质和核酸）相互作用来控制信号转导、基因表达、代谢和细胞周期进展等基本生物过程（Ogorek等人，2023；Shahzaib等人，2026；Yang等人，2020）。在这些分子相互作用中，蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）形成了维持细胞组织和功能的基本调控网络，而其失调则会导致癌症、神经退行性疾病和免疫相关疾病等疾病（Gao等人，2026；Qin等人，2021）。因此，准确表征蛋白质相互作用网络的组成、动态和空间组织对于理解生物机制和确定治疗靶点至关重要。然而，细胞内蛋白质关联的短暂性、动态性和空间限制性仍然是传统方法面临的主要挑战。

尽管传统的PPI分析方法功能强大，但它们通常提供的关于活细胞中蛋白质网络的空间和时间组织信息有限。酵母双杂交（Y2H）实验能够进行大规模的二元相互作用筛选，但依赖于异源系统，可能无法完全再现天然细胞环境或翻译后修饰，从而导致潜在的假阳性或假阴性结果（Brückner等人，2009；Xu等人，2023；Yang等人，2026）。共免疫沉淀（Co-IP）被广泛用于验证稳定的蛋白质关联，但在细胞裂解和纯化过程中可能会破坏弱相互作用或短暂相互作用，同时提供的空间信息有限（Greenblatt等人，2024；Kim等人，2023；Milione等人，2024；Ngounou Wetie等人，2014）。亲和纯化结合质谱（AP-MS）可以实现蛋白质复合物的高通量鉴定，但通常无法区分直接相互作用和间接关联，也无法解析它们的空间组织（Gentzel等人，2019；Walport等人，2021）。这些局限性突显了需要在生理条件下捕获分子邻近信息的方法的必要性。

邻近标记（PL）作为一种强大的策略，可用于在活体细胞中绘制蛋白质邻域和空间分子图谱。在PL中，催化酶或光敏剂被靶向到蛋白质、细胞器、膜或其他感兴趣的区域，在那里生成短寿命的反应性中间体，这些中间体会在有效的标记范围内共价标记附近的生物分子（Xu等人，2023）。这些被标记的蛋白质随后通过质谱（MS）进行富集和鉴定，从而能够全面分析邻近的蛋白质组（Gao等人，2026；Shkel等人，2022；Wang等人，2026；Xu等人，2021）。

重要的是，PL的标记范围应理解为一种依赖于环境的有效邻近范围，而不是固定的物理边界。最近使用空间条形码方法的研究表明，标记结果取决于多种因素，包括反应性中间体的寿命、扩散行为、反应动力学、分子可及性和短暂分子组织（Yang等人，2025）。因此，PL衍生的数据集代表了基于邻近关系的相互作用图谱，而不是直接物理相互作用的决定性证据。这些图谱可能包括直接结合伙伴、短暂关联的蛋白质以及空间上相邻的分子。这种能力使PL能够在接近生理条件的情况下捕获动态和短暂的分子关联，而无需事先知道候选伙伴的信息，同时保留了亚细胞空间信息（Béganton等人，2019；Lobingier等人，2017）。通过PL识别的候选相互作用可以使用正交方法进行验证，以补充直接评估物理分子相互作用的传统方法。

本文首先总结了基于酶的PL系统，包括整个酶平台和分割酶策略。我们讨论了它们的催化机制、标记动力学、有效标记范围以及在信号通路、病原体-宿主相互作用和细胞器接触位点相关的蛋白质邻域分析中的应用。还批判性地比较了这些系统的优势、局限性和应用场景。然后，我们讨论了基于金属复合物、有机发色团和基因编码光催化剂的新兴光催化邻近标记（PPL）方法。这些光激活系统提供了增强的时空控制，并在不常规使用外源性过氧化氢（H?O?）的情况下生成反应性中间体。最后，我们强调了提高PL在复杂生物系统中的空间精度、生物相容性和适用性的当前挑战和未来发展方向。

章节片段

基于酶的邻近标记技术

基于酶的PL是最成熟且应用最广泛的PL技术。在这些方法中，通用的标记酶通过基因融合到感兴趣的蛋白质上，或被靶向到特定的亚细胞位置，生成短寿命的反应性中间体，在有效的标记范围内共价标记邻近的生物分子。根据催化单元的结构组织，基于酶的PL平台可以分为整个酶系统...

光催化邻近标记技术

PPL利用光催化剂在可见光或长波长光（例如红光）照射下通过光诱导的能量或电子转移过程生成高反应性的中间体（例如单线态氧、卡宾、硝基和各种自由基）（Ben-Oz和Hananya，2025；Fang和Zou，2023；Miao等人，2025）。这些中间体会共价标记光催化剂周围的邻近生物分子，从而实现高时空分辨率的蛋白质邻域映射...

总结与结论

PL技术通过能够在活体系统中空间限制且无偏地识别分子邻域，改变了蛋白质相互作用网络的研究。与传统的相互作用方法相比，PL可以捕捉弱相互作用、短暂相互作用和依赖环境的分子关联，同时保持了生理相关性。基于酶的PL和PPL平台的最新进展扩展了邻近蛋白组学的范围，从细胞器组织和膜接触...

未来展望

PL技术的未来发展将集中在提高定量精度、建立标准化的基准框架、扩展在复杂生物系统中的应用以及实现分子组织的多维分析上。对于PPL而言，主要挑战包括增强组织穿透性、优化催化剂和探针的递送以及减少光毒性。深红/近红外激活策略的进步，以及改进的基因编码...

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Shu-Lin Liu：写作——审稿与编辑，撰写——原始草稿，监督，资源获取，项目管理，资金筹措。Zhi-Gang Wang：写作——审稿与编辑，撰写——原始草稿，监督，资源获取，项目管理，资金筹措。Hua-Qian Yin：撰写——原始草稿，可视化，概念构思。Shiwu Zhang：撰写——原始草稿，概念构思

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致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号22374138）和天津市自然科学基金（编号24JCZDJC01240、25JCZDJC01080）的支持。

Hua-Qian Yin|Shiwu Zhang|Shu-Lin Liu|Zhi-Gang Wang|国家药物化学生物学重点实验室，新有机物质前沿科学中心，天津生物传感与分子识别重点实验室，分析科学研究中心，化学学院，医学院，细胞响应前沿科学中心，天津300071，中国