《Biotechnology Advances》：Emerging strategies for regulating Cas12a and Cas13a
trans-cleavage activity in biosensing
编辑推荐：
摘要CRISPR-Cas12a 和 Cas13a 已成为分子诊断和生物传感领域广泛使用的平台，因为靶标识别可触发旁切核酸酶活性（即 collateral 核酸切割）以实现信号放大。利用这一机制，已开发出众多具有高灵敏度、高特异性和现场检测兼容性的生物传感平台。然而，其分析性能
摘要
CRISPR-Cas12a 和 Cas13a 已成为分子诊断和生物传感领域广泛使用的平台，因为靶标识别可触发旁切核酸酶活性（即 collateral 核酸切割）以实现信号放大。利用这一机制，已开发出众多具有高灵敏度、高特异性和现场检测兼容性的生物传感平台。然而，其分析性能在很大程度上取决于对 反式（trans）切割活性的调控。本综述总结了基于 CRISPR-Cas12a 和 Cas13a 的生物传感系统在分子机制和活性调控方面的最新进展。我们探讨了 Cas12a 和 Cas13a 反式切割背后的靶标识别与构象激活机制。随后，我们分析了 Cas 效应蛋白特性、crRNA 结构与组成、激活剂可及性与结构、反应条件以及报告分子设计如何调控靶标诱导的激活和信号输出。我们进一步强调了这些策略在实现可控激活、可调信号生成以及拓展生物传感应用方面的作用。通过在不同调控层面系统组织这些策略，本综述旨在为设计更具可控性和适应性的 CRISPR 反式切割生物传感系统提供框架。
引言
CRISPR-Cas 系统作为细菌和古菌中的适应性免疫机制，保护宿主细胞免受入侵遗传元素的侵害（Barrangou 等，2007）。根据效应蛋白的组织方式，CRISPR-Cas 系统被分为两大类。第 I 类系统包括 I 型、III 型和 IV 型，使用多蛋白效应复合体；而第 II 类系统包括 II 型、V 型和 VI 型，则依赖单一效应蛋白（Makarova 等，2020）。在第 II 类效应蛋白中，Cas12 和 Cas13——尤其是 Cas12a 和 Cas13a——已成为分子检测的核心工具，因为可编程的靶标识别可以触发对报告底物的非特异性 反式切割（Chen 等，2018；Gootenberg 等，2017）。
在 CRISPR-Cas 检测中，Cas 效应蛋白与 CRISPR RNA（crRNA）组装形成核糖核蛋白（RNP）复合体，通过序列互补性识别靶标核酸。crRNA 包含一个保守的直接重复区，用于支持 Cas 结合，以及一个可编程的间隔区，用于引导靶标识别（Shmakov 等，2015；Zetsche 等，2015）。在典型的 Cas12a 介导的双链 DNA 识别过程中，原间隔序列相邻基序（PAM）的结合促进靶标互作，并在 crRNA 间隔区与靶标链（TS）之间形成 R-loop。有效的靶标结合会激活 RuvC 核酸酶结构域，从而实现对靶标 DNA 的顺式切割以及附近单链 DNA 底物的非特异性 反式切割（Gao 等，2016；Swarts 和 Jinek，2019；Yamano 等，2016）。相比之下，Cas13a 通过 crRNA 引导的碱基配对识别单链 RNA 靶标。crRNA 与靶标 RNA 双链体的形成会诱导两个 HEPN 核酸酶结构域发生构象激活，从而实现靶标 RNA 的切割以及对周围单链 RNA 底物的 反式切割（Abudayyeh 等，2016；Liu 等，2017a）。这些靶标触发的核酸酶活性已被转化为广泛使用的分子诊断平台，包括 DETECTR、SHERLOCK 和 HOLMES（Chen 等，2018；Gootenberg 等，2017；Li 等，2018）。
尽管 反式切割提供了一种强大的信号放大机制，但其性能受靶标触发的激活效率、背景切割以及整合反应系统中核酸扩增与 CRISPR 检测之间的兼容性所影响（Arizti-Sanz 等，2022；Gootenberg 等，2018；Lu 等，2022；Tong 等，2024）。应对这些挑战激发了利用分部件设计、分子工程、化学修饰和光响应控制等策略调控 CRISPR 活性的研究（Ding 等，2025；Huang 等，2026；Liu 等，2025；Yin 等，2025）。由于 反式切割的输出依赖于 Cas 效应蛋白、crRNA、激活剂输入、报告底物和反应环境的协同作用，每个组分均可作为活性调控的潜在干预点。然而，这些策略通常在与特定检测方法设计相关时分别讨论，目前在分子诊断中系统理解 反式切割活性调控的框架仍然缺乏。
本综述聚焦于 CRISPR-Cas12a 和 CRISPR-Cas13a 系统，涵盖靶标识别与 反式切割激活的分子机制。文章进一步讨论了通过 CRISPR 检测方法中不同功能组分调控 反式切割活性的关键策略（图 1）。此外，还探讨了开发更具可控性的基于 CRISPR 的传感系统所面临的剩余挑战和未来方向。
章节摘要
Cas12a 和 Cas13a 反式切割活性的分子机制
CRISPR 反式切割活性源于效应蛋白-引导复合体的靶标诱导激活。在生物传感检测中，最终信号由多个偶联步骤共同决定，包括引导体组装、靶标识别、构象激活、催化位点暴露和报告分子结合。Cas12a 和 Cas13a 共享这一基本激活逻辑，但在靶标识别途径和将靶标结合与核酸酶激活偶联的构象转变方面存在差异。
crRNA 水平的活性调控策略
由于 crRNA 将靶标识别与效应蛋白激活联系起来，其架构的细微变化都可能改变 CRISPR 反式切割的输出。重复序列衍生的手柄区的改变可能影响 Cas 结合和 RNP 组装，而间隔区的改变则可调引导-靶标配对效率和激活效率。因此，这两个区域都已被探索作为控制 反式切割活性的可编程元件（图 5）。
激活剂介导的 CRISPR 活性调控
CRISPR 反式切割始于核酸激活剂驱动形成具有激活能力的 Cas-crRNA-靶标复合体。改变激活剂的可及性、连续性、结构或组装方式，为控制 Cas 活性并将多种分子输入与 反式切割偶联提供了直接手段。激活剂介导的调控策略根据控制 Cas 激活的主要分子事件进行分类，包括片段组装、非经典…
CRISPR 反式切割检测的反应条件调节
酶活性强烈依赖于周围反应环境。偏离适宜范围的条件会损害蛋白质折叠、底物结合和催化周转。在适宜范围内，pH、盐浓度和温度等参数有助于维持催化活性。CRISPR 反式切割遵循相同的生化原则。对于依赖二价金属离子的 Cas12a 及相关核酸酶，反应条件的重要性尤为明显…
报告分子设计与信号输出调节
报告分子将 CRISPR 旁切作用转化为可测量的信号，其切割行为决定了 Cas 激活转化为检测输出的效率。因此，报告分子设计提供了一个下游调控层级，用于调节 反式切割动力学、背景信号和读出性能。
结论与展望
CRISPR 反式切割系统已成为分子传感的多功能平台，其活性在多个水平上受到调控，包括 Cas 效应蛋白、引导 RNA、激活剂、反应环境和报告分子（表 2）。这些策略可解决信号输出弱、过早激活、错配区分不足以及扩增与 CRISPR 检测不兼容等局限性。总体而言，目前研究表明 反式切割并非…
关于生成式人工智能及人工智能辅助技术在写作过程中的声明
在本文撰写过程中，作者使用了 ChatGPT 以改善文章的可读性和语言表达。在使用该工具之后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物的全部内容承担全部责任。
致谢
本研究得到了上海科技创新行动计划医学创新研究项目的资助（资助编号：24DX2800100）。
王晓慧 | 黄雅茹 | 张磊 | 郑乐
