综述：用于RNA疫苗与治疗药物的体外转录：面向可制造性的质量源于设计视角

《Biotechnology Advances》：In vitro transcription for RNA vaccines and therapeutics: a quality-by-design perspective on manufacturability

　　

体外转录（In vitro transcription, IVT）是基于RNA的疫苗和治疗药物中药物物质（drug substance, DS）合成的核心单元操作。随着RNA药物成熟为经过临床验证的产品类别，核心挑战正从临床可行性转向可制造性。本综述将IVT重新定义为一种耦合的、由相互作用驱动的合成过程，在此过程中产品质量和过程性能是在转录期间创建的，而非仅在事后评估。使用质量源于设计（Quality by Design, QbD）框架，分析关键物料属性（critical material attributes, CMAs）和关键工艺参数（critical process parameters, CPPs）如何塑造产品关键质量属性（critical quality attributes, CQAs）和制造关键绩效指标（key performance indicators, KPIs），以及这些关系如何定义IVT设计空间。本综述采用以制造为中心的视角，强调可放大性和稳健性。它将已报道IVT组成的比较分析与转录阶段解析的机制分析相结合，以识别控制转录性能、杂质形成和转录本异质性的主要CMAs和CPPs。进一步展示了IVT设计空间如何决定过程和产品相关杂质负担，进而决定下游可分离性和纯化策略。最后，讨论了计算模型、过程分析技术（process analytical technology, PAT）、软传感器和数字孪生如何将QbD扩展到RNA制造中的数字设计质量（quality by digital design, QbDD）。总体而言，本综述表明IVT制造的持续进步取决于更强的机制理解、更好的标准化以及合成、分析与控制的更紧密集成。

1. 引言
体外转录（IVT）已从分子生物学常规技术发展为RNA疫苗和治疗药物中具有工业意义的合成步骤。早期临床转化受制于RNA本身不稳定及缺乏高效递送系统，脂质纳米颗粒（LNP）递送技术及修饰核苷酸（如假尿苷、N1-甲基假尿苷）的应用极大推动了该领域发展。COVID-19 mRNA疫苗的成功使RNA成为经临床验证的药物模态，但大流行时期的特殊条件掩盖了制造效率问题。后疫情时代，核心挑战从临床可行性转向可制造性，因此需要采用质量源于设计（QbD）框架，系统性地将关键物料属性（CMAs）和关键工艺参数（CPPs）与产品关键质量属性（CQAs）及过程关键绩效指标（KPIs）关联，从而定义合理的IVT设计空间。

2. 从临床可行性到可制造性
IVT不是简单的单酶反应，而是多组分耦合的合成过程。其产物质量与过程性能由CMAs和CPPs的相互作用共同决定，而非独立单因素效应。CQAs涵盖序列同一性、完整性、5′加帽效率、poly(A)特征、双链RNA（dsRNA）含量、免疫刺激杂质负担等；KPIs则包括产量、生产率、酶利用率、成本和下游纯化负担。两者不可互换，KPI优化必须在CQA合规区域内进行。QbD实施面临原料标准化不足的障碍，尤其是RNA聚合酶（RNAP）活性单位缺乏跨供应商可比性，以及模板DNA的形式、拓扑、完整性等属性报告不一致。尽管ICH Q8/Q11等监管框架提供了原则，但IVT特定标准仍待完善。

3. IVT系统
转录过程分为启动子结合、开链复合物形成、启动子逃逸、延伸和终止/run-off释放。RNAP在Mg²⁺参与下催化核苷酸添加循环，并释放焦磷酸（PPi）和质子。Run-off转录虽有利于高产量和酶周转，但末端不稳定性可诱发多个dsRNA形成路径，包括RNA模板引发的随机引物合成、3′端自引发/回环延伸，以及模板末端暴露导致的启动子非依赖反义转录。系统层面需将IVT视为由RNAP、模板DNA、底物、缓冲液/辅因子、辅助酶、辅助试剂等模块组成的耦合整体，各模块的CMAs和CPPs相互制约，共同决定产物质量与过程表现。

4. IVT试剂与QbD
4.1 RNA聚合酶（RNAP）
RNAP是IVT核心催化剂，其CMAs包括酶身份/序列、结构完整性、构象状态、比活性与活性分数、持续合成能力、稳定性、制剂形式及杂质负担。供应商通常以单位定义酶量，但不同来源的活性测定方法差异导致名义单位无法直接换算为等效催化能力。RNAP在起始、延伸和终止阶段分别受启动子可及性、模板构象、底物和Mg²⁺状态、模板末端结构等交互因素影响。工程化RNAP（如热稳定突变体）可改变dsRNA生成和修饰核苷酸接受度，但需重新评估既有CPP-CQA关系。

4.2 模板DNA
模板DNA决定了转录起始位点、产物序列和终止边界，其形式（质粒线性化、PCR产物、滚环扩增产物）在序列保真度、杂质谱和放大路径上存在显著差异。模板CMAs包括启动子身份、初始转录区（ITR）序列、编码poly(A)架构、3′边界完整性、拓扑状态、超螺旋比例、缺刻/线性化状态、残留杂质等。ITR序列影响启动子逃逸和加帽效率；模板末端设计影响run-off行为和dsRNA形成。模板浓度应优先以摩尔浓度或可及启动子摩尔浓度表达，以改善跨研究可比性。

4.3 底物：核糖核苷酸与5′帽类似物
底物系统包括经典NTP和修饰NTP（如N1-甲基假尿苷三磷酸）。修饰核苷酸可下调固有免疫识别并改善翻译，但也会改变RNAP掺入效率、保真度及副产物生成。底物CMAs包括核苷酸身份、纯度、反离子类型、残留NDP/NMP或溶剂、内毒素/核酸酶水平等。总NTP浓度及Mg:NTP比是关键过程参数，但有效底物状态由Mg²⁺-NTP复合物形态而非总浓度决定。5′帽类似物作为起始底物参与转录，其与GTP的竞争比例、身份（二核苷酸或三核苷酸类似物）和化学结构直接影响加帽效率及原料成本。

4.4 反应缓冲液与辅因子
Mg²⁺是IVT必需辅因子，通过双金属离子机制参与磷酸二酯键形成。其有效浓度由在NTP、帽类似物、核酸和焦磷酸之间的分配形态决定，而非名义总浓度。Mg:NTP比是实际可操作的过程参数，但仅可视为形态分布的粗略代理。缓冲液身份（Tris、HEPES等）、pH调节用酸/碱、缓冲容量和反离子类型（氯离子、乙酸根）均影响离子强度、pH稳定性和Mg²⁺-PPi沉淀倾向。高浓度下乙酸根体系可提高产量，而多元羧酸类缓冲液可通过螯合磷酸盐减少沉淀。

4.5 辅助蛋白与酶：RNase抑制剂（RI）与无机焦磷酸酶（PPase）
RI通过高亲和非共价结合RNase A类酶保护新生RNA免遭降解，但其氧化稳定性取决于半胱氨酸残基位置，且不抑制RNase T1/H/S1。PPase将PPi水解为正磷酸盐，有效防止Mg²⁺-PPi沉淀并维持Mg²⁺可及性。两者均以活性单位而非质量报告，且其作用依赖于辅因子、缓冲液和反应进程。它们是保护反应稳定性和RNA完整性的辅助层。

4.6 辅助试剂：还原剂与多胺
还原剂如DTT/TCEP用于维持氧化还原环境，保护T7 RNAP和RI中易氧化半胱氨酸。多胺如亚精胺通过结合核酸部分中和磷酸负电荷，稳定模板和产物构象，但过高浓度会导致模板DNA凝聚和沉淀。常见使用浓度约为2 mM亚精胺，低浓度DTT常见于5–10 mM。该辅助体系有利于保持酶活性和核酸可及性。

4.7 少见或条件性试剂
表面活性剂（如Triton X-100、Tween）和抗泡剂用于降低界面吸附和泡沫异质性；拥挤剂（如PEG、Ficoll）通过排除体积效应改变生物分子相互作用；离液剂（如尿素）在适当浓度下可减少RNA-RNA杂交从而抑制dsRNA形成。这些试剂的采用取决于特定过程失败模式，不构成IVT核心，但可扩展可操作设计空间。

4.8 加帽和加尾酶
后转录酶法加帽使用痘苗病毒加帽酶（VCE）或法斯图病毒加帽酶（FCE）将5′三磷酸RNA依次转化为Cap-0或Cap-1；聚腺苷酸聚合酶（PAP）用于3′端加尾。这些酶法路径使末端修饰与转录解耦，提供更高灵活性，但引入额外酶、辅因子（GTP、SAM、ATP）和中间纯化要求。RNA中间体的完整性、端部可及性和残留物影响转化效率。加帽/加尾相关CMAs包括酶身份、活性分数、制剂稳定性、RNA端部化学状态及PPase辅助等。

4.9 设计空间考量
IVT组成不能视为独立可调参数的集合。各试剂块的固有CMA和交互CMA在共享的物理化学环境中耦合表达。可行设计空间是多维CMA-CPP域，必须同时满足产物CQA约束（完整性、加帽效率、dsRNA负担、效价）和过程KPI约束（产量、成本、稳健性）。表4中报道的组成和条件只是起点而非通用最优解；产品特异性设计空间必须根据目标产物特征（QTPP）和模态差异确立。

5. 受IVT影响的下游纯化策略
粗IVT混合物包含过程相关杂质（NTP、盐、模板DNA、残余酶、焦磷酸镁颗粒）和产物相关杂质（截短RNA、未加帽RNA、dsRNA、RNA-DNA杂合体等）。过程相关杂质主要通过澄清、DNase处理、切向流过滤（UF/DF）和通用色谱去除；产物相关杂质因RNA尺寸、电荷和序列相似性较高，需更选择性技术如oligo(dT)亲和层析、阴离子交换（AEX）或多模式层析、dsRNA专用去除步骤。上游IVT设计直接决定纯化工艺强度、回收率和最终可制造性。

6. IVT计算模型与QbDD
计算模型从早期产量预测发展为涵盖Mechanism、辅助沉淀、pH漂移和过程模式的混合模型，进而支撑软传感器和数字孪生。过程分析技术（PAT）提供实时数据，与机理/数据驱动模型结合可估计不可直接测量的内部状态（如自由Mg²⁺、PPi形态）。数字孪生在更广的pDNA-to-mRNA流程中实现单元操作联动传播。上述工具将QbD扩展为数字设计质量（QbDD），但需跨构建体、批次、规模和质量目标进行验证。

7. 结论/展望
RNA制造的质量是在合成阶段创建的，而非事后检验。IVT可制造性由耦合的CMA-CPP复合体系决定，需更强调过程理解而非孤立优化。未来关键需求包括：原料属性和操作条件的更强标准化、区分隐藏化学状态的先进分析/PAT能力、以及将计算模型从回顾性拟合推进为预测性验证工具。QbDD是QbD的操作延伸，其实现将支持实时质量感知决策。最终目标是将IVT建立为跨mRNA、saRNA、circRNA等多种模态的稳健、模块化、可预测的工程化平台，完成从临床可行性到可靠可制造性的转变。