基于17,967种IMPPAT植物化学物的大规模虚拟筛选发现多种CDR1结合剂并揭示芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷（Apigenin-7-O-glucuronide）是一种针对白色念珠菌（Candida albicans）的潜在CDR1-GSC1双靶点先导化合物及初步体外证据

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Large-scale virtual screening of 17,967 IMPPAT phytochemicals identifies multiple CDR1 binders and reveals Apigenin-7-O-glucuronide as a putative CDR1-GSC1 dual-target lead against Candida albicans with initial in-vitro evidence

　　

论文摘要翻译 由于多药外排转运蛋白和细胞壁生物合成改变介导的白色念珠菌（Candida albicans）抗真菌耐药性日益增加，这要求研究人员发现能够靶向参与耐药性的多条通路的新型抗真菌化合物。在本研究中，研究人员采用了一种集成的计算-实验工作流程，从印度药用植物、植物化学和治疗学（Indian Medicinal Plants, Phytochemistry and Therapeutics, IMPPAT）数据库中识别潜在的抗真菌植物化学物。在虚拟筛选中，研究人员首先针对ATP结合盒（ATP-binding cassette, ABC）外排转运蛋白CDR1筛选了总共17,967种植物化学物，随后进行了分子对接、类药性评估、吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）过滤、分子动力学（MD）模拟以及基于分子力学泊松-玻尔兹曼表面积（MM/PBSA）的结合自由能计算。基于前十种CDR1植物化学物对其他抗真菌耐药相关蛋白的交叉靶向分子对接、分子动力学模拟和MM/PBSA分析显示，芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷（Apigenin-7-O-glucuronide）是唯一一种与CDR1和GSC1均表现出有利相互作用的化合物，表明其具有作为假定双靶点抑制剂的潜力。分子动力学模拟显示了蛋白质-配体相互作用的稳定性，MM/PBSA分析证实芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷是最具能量优势的CDR1抑制剂（ΔGtotal = ?35.56 kJ mol?1），并且也显示出与GSC1的有利结合（ΔGtotal = ?11.69 kJ mol?1）。对赤桉（Eucalyptus camaldulensis）水醇提取物的高分辨液相色谱-质谱联用（HR-LCMS）分析，基于精确质量和数据库匹配，提供了芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷存在的推定证据。该提取物还显示出对白色念珠菌ATCC 10231、环境耐药的念珠菌（Candida）以及新兴致病酵母分离株的浓度依赖性抗真菌活性，最低抑菌浓度（MIC）为1.56 mg/mL，最低杀菌浓度（MFC）为6.25 mg/mL。由于生物学评价使用的是粗提的水醇提取物而非纯化的植物化学物，观察到的抗真菌活性不能完全归因于芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷，但这为计算预测提供了初步的生物学支持，并强调了未来需要使用纯化化合物和靶点特异性机制研究进行验证的必要性。总之，这些发现将芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷确定为一种假定的双靶点抗真菌先导化合物，并证明了将大规模虚拟筛选与初步生物学评价相结合用于天然产物抗真菌药物发现的价值。

论文主体内容解读

研究背景与目的

随着免疫受损人群的增加，侵袭性真菌感染已成为日益严峻的全球健康挑战，每年影响超过十亿人，导致超过150万人死亡。世界卫生组织（WHO）已将白色念珠菌（Candida albicans）列为亟需研究和开发新疗法的最高优先级真菌病原体之一。唑类药物是目前治疗念珠菌病最常用的抗真菌药物，但其长期和不加区分的使用导致了多重耐药菌株的出现，这是导致治疗失败和感染复发的主要原因。白色念珠菌的抗真菌耐药机制是多因素的，其中由ATP结合盒（ABC）转运蛋白介导的药物主动外排是关键机制之一。耐药蛋白1（CDR1）是主要的ABC外排转运蛋白，负责临床上的唑类耐药。因此，寻找能够抑制CDR1的化合物对于恢复抗真菌药物的敏感性至关重要。此外，由于抗真菌耐药是由多个相互关联的分子通路协同作用的结果，同时靶向CDR1和其他耐药相关蛋白（如细胞壁β-(1,3)-葡聚糖合酶GSC1）的多靶点策略被认为是提高疗效和降低耐药性产生的更有前景的方法。天然产物因其结构多样性和多药理特性，是发现新型抗菌药物的宝贵来源。尽管已有许多研究报道了不同植物化学物的抗真菌活性，但针对印度药用植物中植物化学物对CDR1抑制作用的系统性大规模研究仍然缺乏。因此，本研究旨在通过整合的计算-实验工作流程，系统性地从印度药用植物、植物化学和治疗学（IMPPAT）数据库中筛选能够靶向CDR1，并具备多靶点潜力的抗真菌先导化合物。

关键技术方法概述

研究人员采用了集成的计算-实验工作流程。在计算方面，首先利用AutoDock Vina软件对来自IMPPAT数据库的17,967种植物化学物进行针对CDR1蛋白的结构虚拟筛选。随后，通过SwissADME和ADMETlab等工具对候选化合物进行类药性和ADMET性质评估。对优选出的化合物，使用GROMACS软件进行100 ns的分子动力学（MD）模拟，并通过MM/PBSA方法计算结合自由能，以评估复合物的动态稳定性和结合强度。为了探索多靶点潜力，还对候选化合物进行了针对其他五个抗真菌耐药相关蛋白（CDR2, ERG1, ERG6, ERG11, GSC1）的交叉靶向分子对接。在实验方面，研究人员选择含有优先化合物的药用植物（如赤桉 Eucalyptus camaldulensis）进行水醇提取，并通过高分辨液相色谱-质谱联用（HR-LCMS）技术对提取物中的化学成分进行表征。最后，通过琼脂扩散法和微量肉汤稀释法评估提取物的体外抗真菌活性。

研究结果

3.1 靶蛋白结构的制备与验证

研究人员制备并验证了六个白色念珠菌抗真菌耐药相关蛋白（CDR1, CDR2, ERG1, ERG6, ERG11, GSC1）的三维结构模型。拉马钱德兰图（Ramachandran plot）分析表明，所有蛋白模型的立体化学质量良好，适用于后续的分子对接和分子动力学模拟。

3.2 活性位点预测与大规模虚拟筛选确定多个推定的CDR1抑制剂

通过对17,967种植物化学物进行虚拟筛选，并根据对接分数、氢键相互作用、类药性和ADMET性质进行逐步筛选，最终确定了10种先导植物化学物。其中，Shihulimonin A（?10.4 kcal/mol）、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷（Apigenin 7-glucuronide, ?10.2 kcal/mol）和Isosalipurposide（?9.6 kcal/mol）表现出最高的预测结合亲和力。

3.3 交叉靶向分析确定芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷为推定的CDR1-GSC1双靶点先导化合物

在对10种先导化合物进行交叉靶向对接后，研究人员发现芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷是唯一一种同时对CDR1（?10.2 kcal/mol）和GSC1（?9.5 kcal/mol）表现出有利结合亲和力的化合物。这表明其可能通过同时干扰药物外排和细胞壁生物合成来发挥双重抗真菌作用。

3.4 分子动力学模拟揭示顶级CDR1先导植物化学物的稳定结合

对9种（Cudraflavone C的模拟失败）CDR1-配体复合物进行的100 ns分子动力学模拟显示，大多数复合物在整个模拟过程中保持稳定。特别是，Shihulimonin A、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷和Rhynchosin表现出最稳定的轨迹。均方根波动（RMSF）、回转半径（Rg）和溶剂可及表面积（SASA）分析进一步证实，配体结合未破坏蛋白质的整体结构和稳定性。氢键占有率分析表明，芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷与CDR1形成了持续且稳定的氢键相互作用。

3.5 芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷与CDR1和GSC1的比较分子动力学

对芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷与CDR1和GSC1复合物的比较分子动力学模拟结果显示，这两个复合物在整个100 ns模拟中都表现出良好的结构稳定性、紧凑的蛋白质构象、有限的残基波动和持续的分子间相互作用。这为芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷作为双靶点先导化合物提供了动态证据。

3.6 MM/PBSA结合自由能分析

MM/PBSA结合自由能计算结果表明，芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷是与CDR1结合最具能量优势的化合物（ΔG_total = ?35.56 kJ/mol），其结合主要由范德华力和静电相互作用驱动。相比之下，最初对接得分最高的Shihulimonin A在动态模拟后表现出轻微的正结合自由能（+1.31 kJ/mol），表明其初始对接构象在动态条件下不稳定。此外，芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷与GSC1的结合也显示出有利的能量（ΔG_total = ?11.69 kJ/mol）。

3.7 赤桉提取物的HR-LCMS表征

通过HR-LCMS分析，研究人员在赤桉（Eucalyptus camaldulensis）的水醇提取物中，基于精确质量数（m/z 447.31）和数据库匹配，推定性鉴定出了芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷的存在，为计算预测提供了分析支持。

3.8 初步体外证据支持计算预测

赤桉提取物对白色念珠菌ATCC 10231以及环境耐药念珠菌和新兴致病酵母分离株均表现出浓度依赖性的抗真菌活性，最低抑菌浓度（MIC）为1.56 mg/mL，最低杀菌浓度（MFC）为6.25 mg/mL。虽然这些活性不能完全归因于单一的芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷，但为计算预测提供了初步的生物学支持。

结论与意义

本研究的结论是，通过整合大规模虚拟筛选、分子动力学模拟和初步生物学评价的工作流程，成功地从IMPPAT数据库中识别出芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷（Apigenin-7-O-glucuronide）作为一种推定的、能够同时靶向CDR1外排泵和GSC1细胞壁合成酶的双靶点抗真菌先导化合物。这项研究的意义在于，它展示了一种高效的、基于结构的天然产物药物发现策略，可以快速筛选和优先排序具有多靶点潜力的先导化合物，以应对日益严重的真菌耐药性问题。同时，研究也明确指出，由于当前的生物学评价是基于粗提物而非纯化化合物，未来的工作需要分离纯化的芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷并进行靶点特异性的机制研究，以最终确认其作为抗真菌药物的价值。