乳酸脱氢酶A缺失破坏R-loop稳态并诱导乳腺癌细胞DNA损伤

《Frontiers in Genetics》：Loss of lactate dehydrogenase A disrupts R-loop homeostasis and induces DNA damage in breast cancer cells

　　

引言：R-loop是由RNA-DNA杂交体和被置换的单链DNA（single-stranded DNA, ssDNA）组成的三链核酸结构，受到单链DNA结合蛋白的严格调控。然而，乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A, LDHA）作为一种非典型DNA结合蛋白和关键糖酵解酶，在R-loop调控中的作用仍不清楚。方法：采用切割靶标与标记测序（Cleavage Under Targets and Tagmentation sequencing, CUT&Tag-seq）绘制野生型（wild-type, WT）和LDHA敲除（knockout, KO）4T1细胞中R-loop和LDHA的基因组图谱。利用RNA-seq进行转录组分析。使用免疫荧光评估LDHA与R-loop的共定位。通过蛋白质印迹检测LDHA、RNase H1和γ-H2AX的蛋白水平。结果：LDHA敲除破坏了R-loop稳态，导致S9.6富集峰改变，在4T1细胞中199个峰增加，81个峰减少。外源性乳酸不能挽救这些R-loop扰动，表明LDHA通过其代谢活性之外的机制调控R-loop。基因组分析显示LDHA结合位点与R-loop倾向区域部分重叠，提示LDHA在R-loop形成中具有潜在直接作用。转录组分析显示LDHA缺失后出现广泛的基因表达变化，但只有4个基因同时与LDHA结合和R-loop峰相关。重要的是，LDHA敲除诱导R-loop灶积累和DNA损伤，两者均可被RNase H1表达逆转。讨论：这些发现将LDHA鉴定为R-loop的新型调控因子，并提示其可能通过直接DNA结合而非仅仅通过其在糖酵解中的酶促作用影响R-loop稳态。需要进一步研究阐明LDHA介导的R-loop调控的分子机制。

论文解读：乳酸脱氢酶A缺失破坏R-loop稳态并诱导乳腺癌细胞DNA损伤

R-loop是由RNA-DNA杂交体和被置换的单链DNA（single-stranded DNA, ssDNA）组成的三链核酸结构，主要在转录过程中形成。R-loop在转录调控、DNA修复、染色质组织、端粒维持和免疫逃逸等生理过程中发挥重要作用，但其异常积累或持续存在会导致复制应激、DNA损伤和转录-复制冲突，进而成为基因组不稳定性的重要来源。单链DNA结合蛋白（single-stranded DNA-binding proteins, SSBs）是调控R-loop水平的关键因子。乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A, LDHA）是糖酵解关键酶，催化丙酮酸还原为乳酸，同时也是一种非典型SSB，可结合单链DNA并参与转录和DNA复制调控。然而，LDHA是否影响R-loop稳态尚不清楚。为此，研究人员利用CRISPR-Cas9构建LDHA敲除（knockout, KO）的4T1小鼠乳腺癌细胞，通过多组学手段系统探究LDHA对R-loop的调控作用。

研究人员通过切割靶标与标记测序（Cleavage Under Targets and Tagmentation sequencing, CUT&Tag-seq）、RNA-seq、免疫荧光和蛋白质印迹等方法，发现LDHA敲除导致R-loop稳态破坏，且该效应不依赖于其代谢产物乳酸；LDHA结合位点与部分R-loop区域重叠，LDHA在体外可直接与R-loop样结构结合；LDHA敲除诱导R-loop积累和DNA损伤，过表达RNase H1可逆转。这些发现将LDHA鉴定为R-loop的新型调控因子，扩展了对其非经典功能的认识。

关键技术方法包括：CRISPR-Cas9基因编辑构建LDHA-KO 4T1细胞（细胞系购自中国科学院细胞库，上海）；CUT&Tag-seq绘制R-loop（S9.6抗体）和LDHA结合位点全基因组图谱；RNA-seq分析转录组变化；免疫荧光检测LDHA与R-loop共定位及DNA损伤；Western blot检测LDHA、RNase H1、γ-H2AX蛋白水平；体外退火合成R-loop样结构，并采用免疫沉淀和过滤DNA结合实验验证LDHA与R-loop的直接结合。

研究结果如下：

1. 4T1细胞中R-loop峰的基本特征（Fundamental characteristics of R-loop peaks in 4T1 cells）：利用S9.6抗体进行CUT&Tag-seq，发现R-loop峰相对弥散，但信号在转录起始位点（transcription start site, TSS）附近及上游约1.5 kb处明显增强；R-loop峰长度多小于250 bp；LDHA敲除或外源乳酸补充不改变其相对位置。

2. LDHA敲除引起的差异R-loop峰（Differential R-loop peaks caused by LDHA knockout）：与野生型（wild-type, WT）相比，LDHA-KO细胞中199个R-loop峰显著增加，81个显著减少；主成分分析及双因素方差分析确认LDHA敲除显著改变R-loop峰数量（p < 0.0001），而外源乳酸补充无显著影响（p = 0.8916）。代表性位点Csf2ra、Zfp438和Gas5的R-loop峰在LDHA敲除后均增加。KEGG富集显示差异峰富集于阿尔茨海默病、神经退行性疾病和乳腺癌通路；GO分析显示主要影响染色质组织等生物学过程。

3. LDHA结合的DNA序列与R-loop区域部分重叠（The DNA sequences bound by LDHA partially overlap with the R-loop region）：LDHA结合位点富集于TSS附近，主要位于启动子区域；联合分析发现263个差异R-loop峰相关基因中65个具有LDHA结合位点；免疫荧光显示LDHA与R-loop在细胞核和细胞质中部分共定位。

4. LDHA在体外与合成的R-loop样结构结合（LDHA bound with synthesized R-loop-like substrates in vitro）：体外退火合成了来源于Csf2ra和Zfp438位点的R-loop样结构，S9.6抗体免疫沉淀验证其形成；过滤DNA结合实验显示LDHA与R-loop结合，而RNase H处理或Galloflavin（破坏LDHA与单链DNA结合的化合物）可消除该相互作用。

5. LDHA缺失诱导的转录组改变及其与R-loop的关联（Transcriptome alterations induced by LDHA and their association with R-loops）：RNA-seq显示LDHA敲除导致363个基因上调和964个基因下调；与差异R-loop峰及LDHA结合位点整合后，仅4个基因同时与两者相关，提示LDHA可能不主要通过R-loop直接调控转录。此外，多个DNA结合蛋白基因（Lig4、Tert、Egr1、Spo11）表达发生显著变化，可能间接影响R-loop稳态。

6. LDHA敲除增加R-loop积累和基因组不稳定性（Increased R-loop accumulation and genomic instability following LDHA knockout）：Western blot显示LDHA-KO细胞中DNA损伤标志物γ-H2AX水平升高，外源乳酸仅部分降低该水平；在LDHA-KO细胞中过表达RNase H1-Flag可降低γ-H2AX水平并减少核内R-loop积累，表明R-loop参与LDHA缺失诱导的DNA损伤。

讨论部分指出，LDHA敲除以不依赖乳酸的方式改变R-loop全基因组分布；LDHA能够结合R-loop样结构，且其结合位点与部分差异R-loop峰重叠。LDHA缺失引起的R-loop积累可部分解释基因组不稳定性的发生。研究结论可翻译为：在本研究中，研究人员确定了LDHA与R-loop之间的新关联。研究证明LDHA调节R-loop稳定性，从而保护基因组稳定性。总之，这些发现加深了研究人员对LDHA非经典功能的理解，并为其多效性生物学作用提供了新的实验证据。未来仍需阐明LDHA调控R-loop的详细分子机制，并需在更多物种（包括人类细胞）中验证这些发现的普适性。