黄芪多糖通过抑制JAK-STAT1/CIITA与TLR/NF-κB信号通路拮抗抗PD-1在黑色素瘤中的疗效

《Frontiers in Immunology》：Astragalus polysaccharide antagonized anti PD-1 efficacy in melanoma through inhibiting JAK-STAT1/CIITA and TLR/NF-κB signaling

　　

摘要专业翻译 目的： 晚期黑色素瘤因对免疫检查点抑制剂（ICIs，如抗PD-1）耐药而仍是重大临床挑战。黄芪多糖（APS）是一种临床批准的用于肿瘤治疗的免疫调节剂。然而，其与抗PD-1的相互作用在很大程度上仍不清楚。本研究旨在探讨APS联合抗PD-1在黑色素瘤中的疗效及其潜在机制。 方法： 在体内研究中，研究人员在B16-OVA黑色素瘤小鼠模型中评估了APS联合抗PD-1的抗肿瘤效果。在机制探索中，研究人员采用免疫组织化学、流式细胞术、ELISA、PCR芯片、qRT-PCR、Western blotting和共聚焦显微镜检测肿瘤免疫微环境变化及相关信号通路激活。 结果： 出乎意料的是，APS显著拮抗了抗PD-1在黑色素瘤小鼠中的抗肿瘤疗效。APS逆转了抗PD-1诱导的肿瘤微环境中CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和树突状细胞（DCs）的浸润，并损害了DC成熟和CD4+ T细胞活化。机制上，APS显著抑制JAK-STAT1信号通路，下调MHCII主调控因子CIITA，进而降低MHCII表达。同时，APS显著抑制B16-OVA黑色素瘤细胞和DCs中的TLR信号通路，并减弱NF-κB介导的炎症反应。 结论： APS通过双重抑制JAK-STAT1/CIITA信号通路和TLR/NF-κB信号通路诱导免疫抑制微环境，从而拮抗抗PD-1疗效。该研究提示，天然多糖与ICIs的联合使用需谨慎，尽管仍需进一步研究以验证这些发现并确定其临床相关性。

论文解读

一、研究背景与科学问题

皮肤黑色素瘤是最致命的皮肤癌类型。免疫检查点抑制剂（ICIs，如抗PD-1）的出现彻底改变了晚期黑色素瘤的治疗格局，显著提高了患者生存率。然而，抗PD-1耐药仍是重大临床挑战，约30%-40%的患者最终出现治疗失败。因此，寻找抗PD-1增敏剂是当前研究热点。主要组织相容性复合体II类（MHCII）分子在激活CD4⁺ T细胞和间接放大CD8⁺ T细胞反应中发挥关键作用。肿瘤细胞包括黑色素瘤细胞可表达肿瘤特异性MHCII（tsMHCII），其与接受抗PD-1治疗患者的治疗反应和预后呈强相关性。MHCII转录受其主调控因子CIITA调控，而CIITA本身受JAK-STAT通路严格控制。在肿瘤微环境中，功能性JAK-STAT1信号对于IFN-γ驱动的CIITA转录和充分的MHC-II表达不可或缺，该信号级联的缺陷常导致肿瘤免疫逃逸。值得注意的是，JAK-STAT通路对抗PD-1治疗的疗效至关重要。Toll样受体（TLR）通路是先天免疫的基石，通过激活NF-κB信号和诱导I型干扰素启动信号级联，驱动促炎细胞因子产生和树突状细胞（DCs）成熟。已有报道TLR激动剂可通过重编程肿瘤微环境并激发先天性和适应性免疫反应，作为ICIs的强效增敏剂。天然多糖广泛分布于植物、动物、真菌、藻类和微生物等多种生物来源，许多多糖已开发为临床批准药物，如黄芪多糖（APS）、香菇多糖和茯苓多糖。APS源自补气中药黄芪，已被证明可改善癌症患者的免疫力。然而，APS与抗PD-1的相互作用在很大程度上仍不清楚。本研究旨在探讨APS联合抗PD-1在黑色素瘤中的疗效及潜在机制。

二、研究内容与主要结论

研究人员在B16-OVA黑色素瘤小鼠模型中系统评估了APS联合抗PD-1的疗效。出乎意料的是，APS显著拮抗了抗PD-1的抗肿瘤疗效。机制研究表明，APS通过双重抑制JAK-STAT1/CIITA信号通路和TLR/NF-κB信号通路，诱导免疫抑制微环境，从而损害抗肿瘤免疫应答。该研究首次报道天然多糖可拮抗ICIs在癌症中的疗效，提示天然多糖与ICIs联合使用需谨慎。

三、关键技术与方法

研究人员采用了多种关键技术方法。首先，通过网络药理学分析预测APS可能影响的信号通路，利用Genecards数据库、STRING数据库和DAVID数据库进行靶点预测、蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析和GO/KEGG富集分析。其次，在B16-OVA黑色素瘤小鼠模型（C57BL/6J小鼠，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司）中进行体内疗效评估。此外，运用免疫组织化学（IHC）检测肿瘤组织中免疫细胞浸润，流式细胞术检测细胞表面标志物表达，PCR芯片和qRT-PCR分析基因表达，Western blotting检测蛋白表达及磷酸化水平，ELISA检测细胞因子分泌，共聚焦显微镜观察NF-κB亚细胞定位。还建立了骨髓来源树突状细胞（BMDCs）培养体系及DCs与CD4⁺ T细胞共培养系统，以评估DC成熟和T细胞活化功能。

四、研究结果

4.1 网络药理学预测JAK/STAT1信号和TLR信号为APS影响抗PD-1疗效的候选通路

通过交集APS潜在靶点、黑色素瘤相关基因和抗PD-1相关靶点，鉴定出56个重叠基因。PPI网络分析揭示IL-6、TNF和TLR4为核心节点。GO富集分析显示这些靶点主要参与脂多糖（LPS）细胞反应和细胞因子活性等生物学过程。KEGG通路富集分析突出显示JAK-STAT信号和TLR信号为最显著富集的信号级联。

4.2 APS在黑色素瘤荷瘤小鼠中拮抗抗PD-1疗效

在B16-OVA黑色素瘤小鼠模型中，APS单独组与对照组相比肿瘤体积无差异。抗PD-1单独组显著抑制肿瘤生长。然而，APS联合抗PD-1组与抗PD-1单独组相比肿瘤体积显著增加，表明APS拮抗了抗PD-1的抗肿瘤疗效。

4.3 APS逆转抗PD-1诱导的肿瘤微环境中免疫细胞浸润

IHC分析显示，抗PD-1单独组显著促进CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和CD11c⁺ DCs向黑色素瘤组织的浸润，而添加APS后这些效应被显著逆转。

4.4 APS抑制JAK-STAT1/CIITA信号通路并下调MHCII表达

Western blot结果显示，APS处理显著抑制B16-OVA细胞和DCs中STAT1的磷酸化。APS处理可下调Ciita mRNA水平和CIITA蛋白表达。与CIITA抑制一致，APS处理显著降低B16-OVA细胞和DCs中MHCII亚基（H2Aa、H2Ab1）的mRNA水平，流式细胞术证实MHCII表达显著降低。IHC数据显示抗PD-1单独促进黑色素瘤组织中MHCII表达，而添加APS后这些效应被显著逆转。

4.5 APS下调TLR/NF-κB信号通路并抑制促炎细胞因子

PCR芯片分析显示，APS暴露显著抑制核心TLR信号介导因子的转录，包括上游损伤相关分子模式基因Hmgb1、中间信号分子Hras1和Map2k4、干扰素基因Ifnb1以及模式识别受体Tlr2、Tlr3和Tlr6。免疫荧光染色显示APS处理显著抑制LPS/IFNγ诱导的B16-OVA细胞中NF-κB核积聚。相应地，APS处理抑制了B16-OVA细胞和DCs中关键促炎细胞因子（TNF-α和IL-6）的产生。

4.6 APS损害DC成熟及后续CD4⁺ T细胞活化

流式细胞术分析显示，APS处理显著下调DC成熟标志物（MHC-II、CD11c、CD80和CD86）的表达。在DCs与CD4⁺ T细胞共培养系统中，APS处理的DCs表现出降低的激活CD4⁺ T细胞能力，表现为CD4⁺ T细胞中CD69（早期活化标志物）显著降低。共培养上清液ELISA分析显示，APS处理显著抑制CD4⁺ T细胞效应细胞因子TNF-α和IFN-γ的释放。

五、讨论与结论

讨论部分指出，抗PD-1已彻底改变晚期黑色素瘤的治疗格局，但耐药仍是重大挑战。研究人员前期研究报道黄芪注射液对抗PD-1治疗具有拮抗作用，而APS作为黄芪的主要活性成分之一，其对抗PD-1疗效的调节作用尚不清楚。本研究发现APS显著损害抗PD-1在黑色素瘤中的疗效。研究人员前期实验结果还表明，另一种药用多糖香菇多糖对抗PD-1疗效表现出类似的拮抗作用，提示天然多糖可能固有地对抗免疫检查点抑制剂。免疫细胞浸润与抗PD-1疗效高度相关，APS诱导的免疫抑制微环境为抗PD-1疗效降低提供了潜在的免疫学解释。MHCII分子对于向CD4⁺ T细胞呈递抗原至关重要，APS显著降低DCs和黑色素瘤细胞中MHCII表达，提示肿瘤微环境中抗原呈递能力受损。TLR通路激活已知可使肿瘤对抗PD-1治疗增敏，APS抑制TLR/NF-κB信号可减少炎症细胞因子产生和DC共刺激活性，从而创造不利于有效T细胞启动的条件。研究局限性包括：仅评估单一剂量APS、单一B16-OVA黑色素瘤模型且队列规模有限、机制实验主要使用鼠源细胞和组织、未系统分析Tregs、MDSCs和M2极化巨噬细胞等主要免疫抑制细胞群、标准B16-OVA模型未能完全模拟晚期癌症患者的虚弱状态和免疫耗竭。

研究结论：APS通过诱导免疫抑制微环境显著拮抗抗PD-1在黑色素瘤中的治疗疗效，这些效应至少部分依赖于抑制JAK-STAT1/CIITA和TLR/NF-κB信号通路。据研究人员所知，这是首次报道天然多糖可拮抗ICIs在癌症中的疗效。该研究提示，癌症患者联合使用天然多糖与ICIs应谨慎。