双重阻断腺苷A2A与A2B受体是逆转NECA诱导的人巨噬细胞免疫抑制所必需：对癌症免疫治疗的启示

《Frontiers in Immunology》：Dual blockade of adenosine A2A and A2B receptors is required to reverse NECA-induced immunosuppression in human macrophages: Implications for cancer immunotherapy

　　

肿瘤微环境（TME）内腺苷的蓄积是有效癌症免疫治疗的主要障碍，其通过腺苷受体信号传导驱动强效免疫抑制。尽管当前临床策略主要靶向A2A腺苷受体，但新出现的证据表明，腺苷介导的免疫调节——尤其是在巨噬细胞等人类髓系细胞中——涉及通过A2A和A2B受体的协同信号传导。本研究首次明确了腺苷类似物5′-N-乙基羧酰胺腺苷（NECA）在人类单核细胞来源巨噬细胞中产生免疫抑制效应的腺苷受体通路，并确定了其对T细胞功能的下游影响。NECA条件处理的巨噬细胞获得了免疫抑制性M2样表型，其特征为促炎细胞因子（IL-12、IL-23、IL-6、TNFα）产生减少，VEGF-A和IL-10表达增加。在功能上，这些巨噬细胞损害了T细胞效应应答，显著削弱Th1型应答，表现为IFNγ产生的消除。重要的是，通过同时阻断A2A和A2B受体，可以实现巨噬细胞极化的逆转和T细胞功能的恢复。这些发现确定了同时抑制A2A和A2B受体作为克服腺苷驱动的免疫抑制并增强靶向肿瘤微环境的癌症免疫治疗疗效的新关键策略的潜力。

论文解读

一、研究背景与问题提出

癌症免疫治疗已彻底改变了部分实体瘤的治疗格局，尤其是转移性黑色素瘤。临床上最常用的免疫治疗为检查点阻断疗法，包括靶向CTLA-4和PD-1/PD-L1受体的单克隆抗体。然而，这类疗法仅在有限比例的癌症和患者中有效。肿瘤微环境（TME）本身是改善免疫治疗的关键靶点，改变这一环境以支持免疫攻击是优先事项。巨噬细胞是决定TME支持还是抑制抗肿瘤免疫的重要介质，在TME中被称为肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），通常呈现促肿瘤的“M2”型表型，产生IL-10和VEGF等抗炎、促肿瘤因子。将这些TAMs重新极化为更具免疫原性的抗肿瘤表型将有助于免疫治疗策略。

腺苷已被证实具有免疫抑制作用，其在TME中的水平可高于生理正常组织。腺苷在细胞外空间由CD39和CD73等外切酶从ATP生成，TME中多种细胞（包括恶性肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞）均表达这些酶。CD73水平在多种癌症中具有预后意义。临床前模型显示，抗PD-1疗法在CD73高表达肿瘤中效果较差，且抗PD-1治疗可诱导腺苷受体上调。

腺苷通过四种G蛋白偶联受体发挥作用：A₁、A_2A、A_2B和A₃。A_2A是高亲和力受体（EC50 <1μM），而A_2B亲和力较低（EC50为24μM）。因此，在腺苷水平较低的正常组织中A_2B作用可能有限，但在腺苷水平较高的肿瘤中其作用变得显著。在T细胞中，腺苷主要通过A_2A受体介导免疫调节效应。目前多种靶向腺苷的药物已进入癌症早期临床试验，多数靶向A_2A受体或CD73。部分研究显示了令人鼓舞的结果，但其他研究显示A_2A或腺苷生成靶向策略的疗效令人失望。这些早期结果提示，可能需要阻断多个腺苷受体以防止TME中腺苷介导的免疫抑制。

已有研究显示，腺苷抑制巨噬细胞关键免疫激活细胞因子（包括IL-12和TNFα）的产生，但A_2A受体单独并不介导这一效应。在人类单核细胞中，腺苷处理可观察到向抗炎表型的转变。重要的是，在某些肿瘤类型中，巨噬细胞比T细胞更有效地介导腺苷的效应。基因表达数据显示，A_2A和A_2B受体均在髓系细胞中表达。然而，大多数研究仅单独考察A_2A或A_2B受体，对两者共表达时的相对贡献研究有限。研究人员假设腺苷通过A_2A和A_2B受体共同信号传导将人类巨噬细胞极化为免疫抑制表型，且需要双重受体阻断才能逆转这一效应。

二、研究内容与主要结论

研究人员使用腺苷类似物NECA（因其半衰期比天然腺苷更长）处理人类单核细胞来源的巨噬细胞，包括GM-CSF分化的巨噬细胞（GMCSF-Mφ）和M-CSF分化的巨噬细胞（MCSF-Mφ），并使用选择性小分子抑制剂SCH442416（A_2A抑制剂）和PSB603（A_2B抑制剂）来确定两种受体的相对贡献。研究首次证明，同时阻断A_2A和A_2B受体是逆转NECA对人类巨噬细胞效应的必要条件。此外，NECA在巨噬细胞分化过程中诱导的细胞因子和趋化因子改变对肿瘤免疫治疗所需的关键适应性免疫细胞产生了显著的下游影响。这些细胞因子和趋化因子的变化仅通过双重A_2A/A_2B受体阻断才能逆转，提示在巨噬细胞浸润显著的肿瘤中，单独A_2A阻断不足以使巨噬细胞重新极化以支持肿瘤免疫治疗。研究还发现，NECA对MCSF-Mφ的影响远大于对GMCSF-Mφ的影响，而MCSF-Mφ更代表TAMs，这证实了开发阻断TME中腺苷对巨噬细胞作用方法的重要性。

三、关键技术方法

研究使用的主要技术方法包括：从健康供体外周血中通过密度梯度离心分离PBMC，再用CD14+磁珠分选获得单核细胞（纯度>95%）；使用GM-CSF或M-CSF将单核细胞分化7天为巨噬细胞；在分化过程中或分化完成后用NECA及腺苷受体抑制剂处理；使用LPS和/或IFNγ刺激巨噬细胞；通过ELISA检测IL-12p70和IL-10，使用定制Luminex Human Magnetic Assay进行多重细胞因子/趋化因子分析；进行异体PBL与巨噬细胞共培养实验以评估对T细胞功能的影响，通过ELISA检测IFNγ、IL-10和IL-17，并通过³H-胸腺嘧啶掺入法检测T细胞增殖；使用流式细胞术分析巨噬细胞表面标志物表达。所有供体均按诺丁汉大学医学院伦理委员会批准的程序招募并提供书面知情同意。

四、研究结果

4.1 腺苷类似物NECA调节完全分化和分化中的人类巨噬细胞功能

GMCSF-Mφ经刺激后呈现HLA-DR^hiCD163^lo表型，产生大量IL-12和少量IL-10；MCSF-Mφ呈现HLA-DR^loCD163^hi表型，产生极少IL-12和较高水平IL-10。对已分化MCSF-Mφ在激活前1小时给予NECA，可浓度依赖性显著降低IL-10产生。NECA处理已分化GMCSF-Mφ显著降低IL-12产生而IL-10不受影响。首次证明，同时阻断A_2A和A_2B受体才能恢复GMCSF-Mφ的IL-12分泌，单独阻断任一受体均不能恢复IL-12产生。在MCSF-Mφ中，NECA对IL-10的作用主要通过单独阻断A_2B即可大部分逆转，而单独A_2A阻断效果甚微。

4.2 同时阻断A_2A和A_2B受体是逆转NECA对分化中人类巨噬细胞作用所必需

与完全分化巨噬细胞中的发现一致，NECA在分化期间存在时显著抑制GMCSF-Mφ的IL-12产生，并显著增加两种巨噬细胞的IL-10分泌能力，导致IL-12:IL-10比值显著降低。联合A_2A和A_2B阻断可恢复NECA条件处理的GMCSF-Mφ的IL-12产生，而单独阻断任一受体均无效。在MCSF-Mφ中，联合阻断可显著降低IL-10产生，而单独阻断无显著效果。

4.3 NECA对人类巨噬细胞功能具有广泛影响，通过A_2A和A_2B受体共同介导

多重分析显示，NECA在MCSF-Mφ分化期间存在可显著降低IL-23、CCL-22、IL-6、TNFα、FGF-b、IL-1β和MMP2的分泌，其中大多数仅在双重A_2A/A_2B阻断下才能显著恢复。VEGF-A被NECA分化显著诱导，且仅通过双重阻断才能完全逆转。NECA分化的MCSF-Mφ的MMP2产生也显著增加。GMCSF-Mφ受NECA极化的影响较小，仅在Eotaxin 2和CCL17方面有显著改变。

4.4 NECA诱导的人类巨噬细胞再极化影响下游T细胞功能

NECA条件处理的MCSF-Mφ显著且强烈抑制T细胞分泌IFNγ的能力，且这种抑制随NECA条件处理的MCSF-Mφ比例增加而更加明显。这种Th1应答的抑制可通过巨噬细胞分化期间的A_2A/A_2B拮抗完全逆转。IL-10和IL-17不受NECA条件处理影响。NECA条件处理的巨噬细胞不改变后续T细胞增殖，证实IFNγ减少是由于NECA分化巨噬细胞导致的淋巴细胞表型改变所致。

五、讨论与结论

本研究的独特之处在于首次在人类巨噬细胞中证明腺苷效应通过A_2A和A_2B受体共同介导，两者在介导NECA对分化中人类巨噬细胞的作用中均不可或缺。当A_2A和A_2B受体共表达时，较低亲和力的A_2B受体往往决定对NECA和腺苷的反应。GMCSF-Mφ与MCSF-Mφ中A_2A与A_2B表达比例的差异可能解释了对单一拮抗剂处理的不同反应。

NECA对MCSF-Mφ的影响远大于GMCSF-Mφ，GM-CSF作为强促炎细胞因子似乎“保护”巨噬细胞免于向M2表型极化。鉴于MCSF-Mφ更代表TAMs，NECA对其多种分泌因子的显著影响证实了开发阻断TME中腺苷对巨噬细胞作用方法的重要性。NECA改变的多项细胞因子和趋化因子为T细胞极化细胞因子，其中最显著的变化之一是VEGF-A的诱导。CCL22的降低将损害T细胞向肿瘤内的迁移，对当前肿瘤免疫治疗效果不利。

研究还观察到NECA在分化期间处理与分化后处理的差异效应，提示受体表达和/或功能在不同类型髓系细胞中有所差异。研究人员正在将研究扩展到多细胞共培养系统，并探索TME中常见的其他因素（包括缺氧、细胞外基质和放疗）的影响。

结论：本研究首次清楚证明A_2A和A_2B受体在介导腺苷类似物NECA对体外分化中人类巨噬细胞的作用中均不可或缺，通过改变其功能表型进而调节下游免疫应答。双重靶向A_2A和A_2B应在体内和临床试验中作为癌症免疫治疗的治疗策略进一步探索。