《Frontiers in Molecular Biosciences》：Inhibition of the Sp1/CTR1 axis attenuates cuproptosis and alleviates axonal injury following intracerebral hemorrhage
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脑出血（intracerebral hemorrhage, ICH）可导致严重的神经功能缺损，继发性神经元损伤是阻碍恢复的主要因素。铜死亡（cuproptosis）是一种铜依赖性的调节性细胞死亡形式，已被认为与代谢应激相关，但其在ICH后轴突损伤中的作用尚不明
脑出血（intracerebral hemorrhage, ICH）可导致严重的神经功能缺损，继发性神经元损伤是阻碍恢复的主要因素。铜死亡（cuproptosis）是一种铜依赖性的调节性细胞死亡形式，已被认为与代谢应激相关，但其在ICH后轴突损伤中的作用尚不明确。本研究采用体内大鼠ICH模型和体外ICH样神经元损伤模型，检测ICH后铜稳态变化、铜死亡相关分子改变及轴突损伤情况。结果显示，血肿周围脑组织和受损神经元中铜水平显著升高，伴随线粒体蛋白脂酰化（lipoylation）减少及二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶（dihydrolipoamide S-acetyltransferase, DLAT）寡聚化增加，与铜死亡相关分子异常一致。特异性蛋白1（specificity protein 1, Sp1）和铜转运蛋白1（copper transporter 1, CTR1）也显著上调，且呈现相似的时间变化模式。同时，ICH诱导轴突损伤相关分子改变，包括淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）表达增加和生长相关蛋白43（growth-associated protein 43, GAP43）表达降低。使用普卡霉素（plicamycin）药理学抑制Sp1可降低CTR1表达、减轻铜过载、改善铜死亡相关分子异常，并在体内和体外实验中改善轴突损伤相关的分子及形态学变化。上述发现提示，Sp1/CTR1相关的铜摄取调控可能参与ICH后继发性神经元损伤，并可能代表一个值得进一步研究的潜在治疗切入点。
论文解读
一、研究背景与科学问题
脑出血（intracerebral hemorrhage, ICH）是卒中类型中致残率和死亡率最高的亚型，幸存者常遗留严重且持续的神经功能缺损。除血管破裂和血肿压迫导致的原发性损伤外，炎症反应、血脑屏障破坏、氧化应激和细胞死亡等继发性损伤是决定临床预后的关键因素。尽管针对这些病理过程已提出多种治疗策略，但临床获益仍然有限，提示ICH后损伤的关键分子机制尚未完全阐明。
神经元死亡是ICH后继发性脑损伤的重要病理事件。血肿降解产物可迅速触发炎症级联反应并诱导氧化应激和代谢紊乱，从而加重神经元损伤。虽然凋亡、坏死性凋亡和铁死亡等多种程序性细胞死亡形式已被证实参与ICH后神经元损伤，但针对这些通路的干预并未显著改善神经功能结局，提示存在其他尚未充分表征的细胞死亡机制。
铜死亡（cuproptosis）是一种新近提出的铜依赖性程序性细胞死亡形式，其特征为铜离子直接结合线粒体脂酰化蛋白，导致其异常聚集、随后的蛋白毒性应激，最终引起细胞死亡。在这一过程中，线粒体代谢因子通过调节脂酰化状态和铜依赖性代谢活性来调控细胞对铜死亡的易感性。其中，铁氧还蛋白1（ferredoxin 1, FDX1）和硫辛酸合成酶（lipoic acid synthetase, LIAS）被认为是铜死亡的正向调控因子，分别通过增强铜还原活性和提供脂酰化底物来促进铜依赖性毒性；而谷氨酰胺酶（glutaminase, GLS）则通过调节谷氨酰胺进入三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）循环的代谢通量来负向调控铜死亡。同时，二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶（dihydrolipoamide S-acetyltransferase, DLAT）等脂酰化蛋白的异常改变及其寡聚化被视为铜死亡的重要分子特征。
铜稳态对中枢神经系统正常功能至关重要。铜作为多种酶的辅因子，参与氧化还原反应、神经递质合成和突触可塑性，并通过铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）相关通路参与抗氧化防御。然而，铜是一把双刃剑：生理水平的铜对细胞生存和功能不可或缺，而铜稳态的破坏——无论是缺乏还是病理性蓄积——均可导致细胞功能障碍和细胞毒性。ICH后，血脑屏障破坏和血肿降解等病理过程导致损伤区域内金属离子异常分布，为细胞内铜稳态失调创造了条件。铜转运蛋白1（copper transporter 1, CTR1）是介导细胞铜摄取的主要转运体，其表达水平是决定细胞内铜负荷的重要因素。CTR1过表达可显著增加细胞对铜的敏感性并诱导铜依赖性细胞死亡。在转录水平上，特异性蛋白1（specificity protein 1, Sp1）可结合CTR1启动子区域并促进其转录，从而参与细胞铜摄取和铜稳态的调控。已有研究报道抑制Sp1活性可下调CTR1表达并减轻铜死亡相关损伤。然而，ICH后神经元中是否存在Sp1/CTR1介导的铜稳态失调，以及该通路是否参与铜死亡相关的继发性神经元和轴突损伤，仍不清楚。
神经元轴突损伤和轴突完整性相关标志物的改变是限制ICH后神经功能恢复的关键因素，尤其当基底节和内囊受累时更为突出。这种损伤不仅直接破坏神经环路，神经元死亡还会进一步诱导轴突变性和运输功能障碍，从而加剧环路损伤。基于此，本研究聚焦铜死亡，探讨其在ICH后继发性神经损伤中的作用，特别关注Sp1/CTR1轴介导的铜稳态调控，旨在从代谢稳态的角度深化对ICH后继发性脑损伤的理解。
二、研究设计与主要结论
研究人员建立了大鼠自体血ICH模型和血红素（hemin）诱导的体外ICH样神经元损伤模型，系统检测了ICH后不同时间点（4 h、12 h、24 h、72 h和120 h）血肿周围脑组织中的铜水平、铜死亡相关分子改变及轴突损伤相关变化。研究发现，ICH后血肿周围脑组织铜水平显著升高，在72 h达到峰值；CTR1、FDX1和LIAS表达呈总体上升趋势，而GLS和脂酰化DLAT表达呈下降趋势。Sp1蛋白表达在ICH组显著高于Sham组，同时伴随APP表达增加和GAP43表达降低。体外实验中，hemin处理诱导神经元铜蓄积、CTR1表达增强、线粒体脂酰化信号减少、DLAT寡聚化增加、Sp1核转位增强以及轴突形态损伤。转录组分析显示，ICH后上调的2665个基因中有779个在普卡霉素（plicamycin, MA）干预后被逆转下调，KEGG富集分析提示PI3K–Akt和p53等代谢应激和细胞死亡相关通路参与其中。进一步验证表明，MA可显著降低Sp1和CTR1的表达，减少细胞内铜蓄积，改善铜死亡相关分子异常（恢复GLS和脂酰化DLAT水平，降低FDX1和LIAS的异常上调），减轻DLAT寡聚化，并改善轴突损伤相关的分子和形态学改变。染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation, ChIP）实验证实，ICH样损伤条件下Sp1在CTR1启动子区域的富集显著增加。体内实验中，MA治疗显著改善了ICH大鼠的神经功能评分，降低了血肿周围脑组织铜水平，并改善了轴突损伤相关蛋白表达。
这些发现提示，Sp1/CTR1相关的铜摄取调控可能参与ICH后继发性神经元损伤，抑制该轴可能为ICH的治疗提供新的潜在靶点。
三、主要关键技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：大鼠自体血ICH模型（采用SD大鼠，购自河南斯克贝斯生物技术有限公司，许可证号SCXK（豫）2025-0005，动物实验方案经贵州医科大学动物伦理委员会批准，批准号2403622）；血红素诱导的体外ICH样神经元损伤模型（使用永生化大鼠皮层神经元细胞系RN-C和原代大鼠皮层神经元）；电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS）检测铜含量；转录组测序（RNA-seq）分析差异表达基因；蛋白质印迹（Western blot）检测蛋白表达；非变性Western blot检测DLAT寡聚化；实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测mRNA表达；染色质免疫沉淀结合定量PCR（ChIP-qPCR）检测Sp1与CTR1启动子区的结合；免疫荧光染色和铜离子特异性荧光探针标记进行形态学观察；CCK-8法检测细胞活力；改良Garcia评分评估神经功能。
四、研究结果
3.1 SD大鼠ICH模型的建立与行为学评估
通过向SD大鼠右侧基底节注射自体全血建立ICH模型，大体标本和冠状脑切片显示ICH组右侧基底节形成稳定血肿，表明模型建立成功。改良Garcia评分显示，ICH后神经功能缺损从4 h至72 h呈整体下降趋势，72 h时均值最低，120 h时部分回升，表明ICH后神经功能缺损呈动态进展。
3.2 ICH后血肿周围铜水平与铜死亡相关分子改变的时间特征
ICP-MS分析显示，ICH后血肿周围脑组织铜水平升高，在72 h达到峰值。Western blot分析显示，CTR1、FDX1和LIAS表达在ICH后呈总体上升趋势，而GLS和脂酰化DLAT表达呈下降趋势。这些结果表明，ICH后血肿周围脑组织中铜蓄积和铜死亡相关分子改变呈现显著的时间依赖性变化。基于72 h时神经功能缺损、铜蓄积、CTR1表达和铜死亡相关分子标志物变化最为集中，选择72 h作为后续实验的主要观察时间点。
3.3 ICH后Sp1上调伴随轴突损伤相关改变
Western blot分析显示，ICH组Sp1蛋白表达显著高于Sham组。同时，ICH组APP表达增加、GAP43表达降低。这些结果表明，ICH后Sp1上调伴随轴突损伤相关分子改变。
3.4 Hemin诱导的ICH样损伤条件与神经元细胞中铜死亡相关分子改变和轴突损伤相关
CCK-8实验显示，随着hemin暴露时间延长，神经元活力进行性下降，72 h时约为50%。铜离子特异性荧光探针信号显著增强，ICP-MS进一步证实细胞内铜水平显著升高。免疫荧光染色显示hemin处理后CTR1荧光强度增加。脂酰化信号主要定位于线粒体，在ICH模拟条件下显著减少。非变性Western blot显示高分子量DLAT寡聚化信号增加，在72 h最为明显。免疫荧光分析显示ICH模拟条件下Sp1核/质比增加，表明Sp1核转位增强。APP免疫荧光显示轴突结构完整性受损，最大轴突长度显著减少。
3.5 转录组分析提示普卡霉素介导的与Sp1/CTR1轴相关的反向调控
对ICH后SD大鼠血肿周围脑组织进行转录组测序，将ICH后显著上调的基因与MA处理后反向下调的基因取交集，鉴定出779个可能受MA调控的核心基因。KEGG富集分析显示这些基因主要富集于PI3K–Akt和p53等代谢应激和细胞死亡相关通路。铜死亡相关转录谱显示，Slc31a1（CTR1）、FDX1和LIAS在ICH后上调并在MA处理后下调，而GLS在ICH后下调并在MA干预后部分恢复。STRING网络分析提示Sp1与CTR1之间存在预测的功能关联。表达分析显示Sp1和CTR1的mRNA水平在ICH后显著升高，MA处理后同步降低。
3.6 ICH模型中Sp1/CTR1轴的体内外验证
RT-qPCR和Western blot分析显示，ICH大鼠血肿周围脑组织中Sp1和CTR1的mRNA和蛋白水平显著升高，MA干预显著降低两者表达。体外实验中，hemin处理后Sp1和CTR1蛋白水平显著升高，MA处理后显著降低。免疫荧光分析显示ICH模拟条件下Sp1核信号增强、核/质比增加，MA处理显著减少Sp1核蓄积；CTR1平均荧光强度在ICH模拟条件下显著增加，MA干预后显著降低。ChIP-qPCR结果显示，ICH模拟条件下Sp1在CTR1启动子区域的富集显著增加。
3.7 Sp1/CTR1轴调控与ICH后铜死亡相关分子改变减轻和轴突损伤缓解相关
体内实验显示，MA治疗显著改善ICH大鼠神经功能评分，降低血肿周围脑组织铜水平，改善铜死亡相关分子异常（恢复GLS和脂酰化DLAT水平，降低FDX1和LIAS的异常上调），降低APP表达并增加GAP43表达。体外实验中，CCK-8实验确定100 nM为MA的工作浓度。在该条件下，MA显著抑制hemin诱导的Sp1和CTR1异常高表达，降低细胞内铜荧光信号和铜水平，减轻FDX1和LIAS的异常上调，部分恢复GLS表达，减弱高分子量DLAT寡聚化信号，DLAT脂酰化水平在蛋白和免疫荧光水平均呈恢复趋势。同时，APP标记的轴突形态异常减少，神经突长度增加。
五、讨论与结论总结
讨论部分指出，ICH后铜稳态破坏的病理意义不仅限于铜离子水平的升高，伴随的铜死亡相关分子改变是潜在的重要病理事件。铜离子浓度升高和CTR1上调并非在ICH后立即达到峰值，而是随着继发性损伤的发展逐渐加剧，在72 h最为显著，这与大鼠ICH模型中脑水肿在24–72 h达峰以及人类ICH后约72 h内继发性损伤快速进展的报道一致。在机制层面，铜主要通过CTR1进入细胞并参与线粒体能量代谢和氧化还原稳态的调节。CTR1表达或活性的异常增强可导致铜内流失调，破坏细胞铜稳态，为铜死亡的诱导创造条件。FDX1和LIAS是线粒体脂酰化通路中的关键节点，共同维持蛋白脂酰化与线粒体代谢功能之间的稳态耦合；GLS作为铜死亡的负调控因子，在ICH后显著下调，干预后部分恢复。在病理铜过载伴随持续代谢应激的条件下，尽管FDX1上调，脂酰化可能仍会降低，这可能反映了脂酰化蛋白稳定性改变或脂酰化能力受损，表现为DLAT脂酰化降低伴随寡聚化增强。在上游调控层面，Sp1可能作为连接ICH诱导的应激环境与铜稳态重塑的重要转录调控因子。ChIP-qPCR证实ICH病理条件下Sp1与CTR1启动子的结合显著增强，为Sp1/CTR1轴参与该过程提供了分子证据。在轴突损伤方面，72 h时间点更接近继发性损伤显著加重的阶段，此时脑水肿接近峰值并伴随显著神经功能缺损，线粒体代谢功能障碍和氧化应激占主导，轴突修复程序尚未有效启动甚至可能受到抑制，导致GAP43下调。
研究结论为：ICH后的病理应激与Sp1活性和CTR1表达增加相关，伴随神经元铜过载、铜死亡相关分子改变以及轴突损伤相关的分子和形态学变化。药理学抑制Sp1可减轻这些改变。综合来看，这些发现支持Sp1/CTR1轴可能参与ICH后继发性神经元损伤，并提示该通路值得在治疗开发背景下进一步研究。
