《Frontiers in Oncology》：Tumor-cell PD-L1 expression, mismatch repair status, and survival outcomes in colorectal carcinoma: a retrospective Pakistani cohort study
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背景：肿瘤细胞程序性死亡配体1（PD-L1）表达已被作为结直肠癌（CRC）的生物标志物进行研究，但报道的阳性率因抗体克隆、评分方法和阈值而异。肿瘤细胞PD-L1并非CRC的验证性伴随诊断工具。本研究以微卫星不稳定性/错配修复（MSI/MMR）状态作为参考生物标
背景：肿瘤细胞程序性死亡配体1（PD-L1）表达已被作为结直肠癌（CRC）的生物标志物进行研究，但报道的阳性率因抗体克隆、评分方法和阈值而异。肿瘤细胞PD-L1并非CRC的验证性伴随诊断工具。本研究以微卫星不稳定性/错配修复（MSI/MMR）状态作为参考生物标志物，评估了使用ZR3克隆进行评分的PD-L1表达是否在一个巴基斯坦队列中发挥临床病理学或预后生物标志物的作用。
方法：研究人员回顾性评估了2020年至2023年间确诊的60例CRC患者。PD-L1表达采用肿瘤比例评分（TPS）和ZR3抗体进行评估。MSI通过基于聚合酶链反应的片段分析确定，MMR状态通过四蛋白免疫组织化学确定。分析了二元PD-L1状态与10个临床病理学变量之间的关联，并使用Benjamini–Hochberg假发现率程序进行调整。总生存期（OS；n=60）、无病生存期（DFS；n=44）和无进展生存期（PFS；n=16）为探索性终点。
结果：在TPS阈值为≥1%时，60例肿瘤中有43例（71.7%）被判定为PD-L1阳性，其中包括31例低阳性和12例高阳性肿瘤。这一比率超过了大多数CRC TPS系列研究，可能反映了克隆特异性和阈值特异性检测行为。经过多重性校正后，无临床病理学变量与二元PD-L1状态相关联。MSI-H/dMMR存在于12例病例（20.0%）中，并与三级PD-L1分类相关（Fisher–Freeman–Halton p=0.0017；Cramér's V = 0.485），但与二元阳性无关（p=0.151）；这种关联仅限于高阳性组。PD-L1状态与OS（HR 1.43, 95% CI 0.40–5.05; p=0.580）、DFS（HR 0.46, 95% CI 0.15–1.45; p=0.185）或PFS（HR 0.67, 95% CI 0.20–2.20; p=0.505）均无关联。年龄较大（而非PD-L1状态）与死亡率相关（校正后HR 1.68每10年, 95% CI 1.09–2.57; p=0.018）。
结论：在该队列中，基于ZR3的肿瘤细胞PD-L1 TPS与临床病理学特征或生存期无关。高阳性率应被视为检测特异性，而MSI-H/dMMR肿瘤在高阳性层级中的富集则与既有的生物学机制一致。基于ZR3的TPS应保持为一种研究性指标，不应独立指导免疫治疗选择；MSI/MMR检测仍然是CRC中具有临床可操作性的生物标志物。
论文解读文章
研究背景与目的
结直肠癌是全球第三大常见恶性肿瘤和第二大癌症相关死亡原因。尽管传统的临床病理学特征如组织学分级、浸润深度、淋巴结受累等仍是主要的预后评估手段，但形态学和分期相似的患者在复发、治疗反应和生存期方面可能存在显著差异，这促使研究者寻找能够补充常规评估的分子和免疫生物标志物。程序性死亡受体1及其配体（PD-1/PD-L1）通路是肿瘤免疫逃逸的关键机制。在结直肠癌中，免疫检查点抑制剂的疗效主要局限于高度微卫星不稳定或错配修复缺陷（MSI-H/dMMR）的肿瘤，因此MSI/MMR状态已成为免疫治疗选择的既定临床可操作性生物标志物。然而，肿瘤细胞PD-L1表达本身并未被验证为结直肠癌的伴随诊断工具。现有文献中，PD-L1的阳性率因抗体克隆、染色平台、评分系统和阈值等因素差异巨大，其预后证据也不一致。来自南亚地区的研究同样显示出异质性。针对巴基斯坦人群的证据仍然有限。因此，本研究旨在利用ZR3克隆评估巴基斯坦结直肠癌队列中肿瘤细胞PD-L1表达的频率，并以MSI/MMR状态作为参考，检验其是否可作为可用的临床病理学或预后生物标志物。研究设计带有审慎的目的：描述检测行为，而非确立PD-L1作为生物标志物。总生存期、无病生存期和无进展生存期仅作为预设的次要探索性终点进行分析。
研究方法概述
这是一项在巴基斯坦白沙瓦医学院进行的分析性回顾性队列研究。研究人员从2020年1月至2023年7月间确诊的78例存档福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）结直肠癌组织中筛选，最终纳入60例符合条件的独特患者，每例选取一个代表性蜡块。研究采用了多种关键技术方法：
- 1.
PD-L1免疫组织化学与评分：使用预稀释的ZR3兔单克隆抗体对5微米厚的FFPE切片进行染色，并由两名病理学家独立评估肿瘤比例评分（TPS），即膜染色阳性肿瘤细胞的百分比。根据TPS将病例分为阴性（<1%）、低阳性（1-49%）和高阳性（≥50%）三个等级。
- 2.
微卫星不稳定性（MSI）检测：从同一蜡块中提取DNA，采用荧光多重PCR片段分析法检测五个准单态单核苷酸标记物（BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-22, NR-24）。根据修订版Bethesda指南，两个及以上位点不稳定判为MSI-H，一个位点不稳定判为MSI-L，无不稳定判为微卫星稳定（MSS）。
- 3.
错配修复（MMR）蛋白免疫组织化学：检测MLH1、MSH2、MSH6和PMS2四种蛋白的表达。任一蛋白核染色完全缺失定义为dMMR，所有蛋白均表达正常定义为pMMR。
- 4.
统计分析：采用Fisher精确检验或Fisher-Freeman-Halton精确检验分析分类变量关联，使用Benjamini-Hochberg法控制假发现率（FDR）。生存分析采用Kaplan-Meier法和Cox比例风险模型。
研究结果
1. 队列特征与PD-L1频率
最终队列包括60例患者，中位年龄57.5岁，男性占81.7%，76.7%为III期或IV期疾病。在TPS≥1%的阈值下，PD-L1总体阳性率为71.7%（43/60），其中低阳性31例（51.7%），高阳性12例（20.0%）。MSI-H/dMMR状态在12例（20.0%）中发现。
2. 二元PD-L1状态与临床病理学关联
经多重性校正后，未发现任何基线临床病理学变量（包括年龄、性别、组织学亚型、分级、肿瘤部位、病理分期、淋巴结状态、脉管侵犯、神经侵犯和MSI/MMR状态）与二元PD-L1状态（阳性vs阴性）存在显著关联。
3. MSI/MMR表型与PD-L1表达的关系
三级PD-L1表达分类与MSI/MMR表型存在显著关联（p=0.0017; Cramér's V = 0.485）。具体而言，MSI-H/dMMR肿瘤在高阳性PD-L1类别中占比58.3%（7/12），远高于其在MSS/pMMR肿瘤中的比例10.4%（5/48）。然而，二元PD-L1阳性与MSI/MMR状态的关联并不显著（p=0.151）。此外，MSI-H/dMMR更多见于右侧结肠肿瘤。
4. 总生存期
中位随访时间为32.8个月，全队列中位OS为50.8个月，共发生17例死亡。PD-L1阳性组与阴性组的OS无显著差异（log-rank p=0.580）。在多变量模型中，年龄每增加10岁与更高的死亡风险相关（校正后HR 1.68, p=0.018），而PD-L1状态仍无显著关联。
5. 无病生存期与无进展生存期
在44例接受根治性治疗后达到无病状态的患者中，PD-L1状态与DFS无显著关联（log-rank p=0.175）。在16例基线存在转移性或残留疾病的患者中，PD-L1状态与PFS也无显著关联（log-rank p=0.503）。由于事件数较少，这些分析效力不足。
6. 三分类PD-L1敏感性分析
由于≥1%的阈值可能掩盖生物学差异，所有分析均使用三分类PD-L1重复进行。结果显示，MSI/MMR状态与三分类PD-L1显著相关（p=0.0017; q=0.014），且呈现单调递增趋势：MSI-H/dMMR在阴性、低阳性和高阳性组中的比例分别为5.9%、12.9%和58.3%。然而，在任何生存终点（OS、DFS、PFS）上，无论采用何种参数化方式，三分类PD-L1均未显示任何预后信号。
讨论与结论
本研究的核心发现是，在巴基斯坦结直肠癌队列中使用ZR3克隆和TPS≥1%阈值检测到的肿瘤细胞PD-L1阳性率高达71.7%，这很可能是检测系统特异性的表现，而非可推广的真实患病率。与这一解释相符的是，二元PD-L1阳性与任何临床病理学特征或生存期均无关联。唯一与已知生物学一致的是MSI-H/dMMR肿瘤在高阳性PD-L1组中的富集，这表明二分类法将生物学性质不同的肿瘤归为一类，掩盖了真实的梯度关系。
研究结论：在本队列中，基于ZR3的肿瘤细胞PD-L1 TPS与临床病理学特征或生存期无关。高阳性率应被视为检测特异性现象。虽然MSI-H/dMMR肿瘤在高阳性层级中富集，但ZR3-TPS不应独立用于结直肠癌患者的预后分层或免疫治疗选择。MSI/MMR检测仍然是结直肠癌中具有临床可操作性的生物标志物。
