母体与新生儿多生物位点真菌DNA谱系特征：一项探索性初步研究

《Frontiers in Microbiology》：Fungal DNA profiles across maternal and neonatal biological sites: findings from an exploratory pilot study

　　

摘要专业翻译 背景： 新生儿真菌组（mycobiome）是早期生命微生物生态学中尚未充分探索的组成部分。尽管真菌可能参与免疫成熟和宿主-微生物互作，但母体与新生儿各生物位点的真菌DNA谱系特征仍缺乏系统描述。本探索性初步研究旨在表征生命早期阶段母体与新生儿多个生物学区室中的真菌DNA谱系特征。 材料与方法： 研究纳入10对胎龄≥37周的母婴配对。选取3对重点母婴配对（1对完整、2对近完整）进行详细真菌组测序分析，另补充母乳样本使总分析标本数达30份。于分娩后48–72小时及产后6周分别采集母体（阴道、直肠、母乳）及新生儿（皮肤、口腔、粪便）样本。采用牛津纳米孔（Oxford Nanopore）长读长18S rRNA测序技术分析真菌DNA，使用Kraken2基于NCBI RefSeq Targeted Loci真菌18S rRNA数据库进行物种分类，并在R环境中利用phyloseq包完成α多样性和β多样性分析。 结果： 共保留428,555条真菌读长，对应107个属级操作分类特征。不同生物位点间真菌DNA谱系存在差异，新生儿皮肤样本中马拉色菌属（Malassezia）相对丰度较高，而胃肠道相关样本呈现更为异质的谱系特征。α多样性在各采样位点间无显著差异，而β多样性提示群落组成存在探索性的位点相关差异。基于丰富度的指标在6周时高于早期采样，但该趋势在校正测序深度后不再稳健，且β多样性分析未显示明确的时间性变化。由于未对阴性对照进行测序，不能排除实验室或试剂来源真菌DNA的污染，研究结果不应被解读为活菌存在或稳定定植的证据。 结论： 本探索性初步研究表明，母体与新生儿不同生物位点的真菌DNA谱系存在差异，且产后6周可检测到的真菌丰富度可能增加，但该发现在校正测序深度后不再稳健。未来需开展更大规模的纵向研究，纳入基于ITS的测序、菌株水平分析、测序技术对照及功能谱分析，以验证上述观察结果并阐明早期生命真菌群落的生物学意义。

论文解读

一、研究背景与问题提出

21世纪以来，微生物组研究在人类与动物领域引发广泛关注。大量研究表明，细菌和真菌是宿主生态系统的重要组成部分，不仅具有致病性，还在人类和动物生理中发挥有益作用。新生儿微生物组的研究日益受到重视，环境因素与遗传因素共同塑造早期微生物定植格局。母体在分娩前后通过子宫内膜、阴道、胃肠道和口腔微生物群影响胎儿发育，而分娩方式、胎龄、喂养方式和产后环境暴露进一步影响早期微生物定植。阴道分娩的新生儿获得母体阴道微生物组特有的细菌，如乳杆菌属（Lactobacillus）、斯尼斯菌属（Sneathia）和普雷沃菌属（Prevotella）；剖宫产婴儿则以母体皮肤相关类群为主，包括葡萄球菌属（Staphylococcus）、丙酸杆菌属（Propionibacterium）和棒状杆菌属（Corynebacterium）。

除细菌外，人类微生物组还包含重要的真菌群落。然而，真菌组（mycobiome）的描述和研究仍显不足。真菌估计约占成人肠道微生物组的13%，涵盖100多个属。越来越多的证据表明，真菌群落参与宿主代谢、营养与维生素吸收、微量元素生物合成、免疫调节及微生物稳态维持。多种疾病状态中观察到真菌组变化，包括炎症性肠病、结直肠腺瘤、贮袋炎和腹泻，以及移植物抗宿主病和雷特综合征等罕见疾病。然而，真菌失调究竟是疾病过程的后果还是疾病病因的贡献因素，目前仍不清楚。因此，研究人类真菌组从出生到死亡的演变过程极为重要。

尽管真菌组研究兴趣日益增长，但关于产前和产后真菌传播仍存在显著知识空白。现有证据表明，分娩方式、饮食和出生胎龄影响婴儿真菌组，但直接研究母婴真菌传播的文献有限。真菌定植常无症状，但机会性真菌（尤其是念珠菌属（Candida））可能在易感新生儿中引起局部或侵袭性感染。早产儿因免疫不成熟、住院时间延长、广谱抗生素暴露和侵入性医疗操作而尤为脆弱。此外，新生儿重症监护室（NICU）中广泛使用的抗生素治疗可诱导真菌组发生质与量的改变，促进致病共生菌过度生长并增加真菌感染风险。多重耐药真菌（如耳念珠菌（Candida auris））的出现进一步凸显了了解住院新生儿真菌定植和感染的临床重要性。细菌-真菌互作也可能影响新生儿微生物定植和群落发育。基于上述背景，为更好理解"正常"新生儿真菌组并建立与生态平衡（eubiosis）相关的真菌定植基线数据，研究人员开展了一项涉及足月新生儿及其母亲的初步研究，旨在表征多个生物位点的真菌DNA谱系并评估临床条件下多位点真菌组分析的可行性。

二、研究设计与方法概述

该研究在波兹南医科大学妇产医院开展，时间跨度为2022年10月至2025年4月，经当地生物伦理委员会批准。研究纳入10对胎龄≥37周的母婴配对，其中3对重点配对（F1、F2、F3）被选入详细测序分析，选择标准基于配对样本完整性和测序产量，而非随机选取。排除标准包括：母体B族链球菌（Group B Streptococcus）定植、孕期及新生儿期抗生素治疗、母体糖尿病、先天性异常及研究期间婴儿死亡。共分析30份标本，涵盖母体（阴道、直肠、母乳）和新生儿（皮肤、口腔、粪便）多个位点，采样时间为分娩后48–72小时和产后6周。样本采集采用无菌拭子和无菌容器，存储于?80°C。DNA提取使用ZymoBIOMICS DNA Mini Prep Kit（拭子和母乳）及QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit（粪便）。真菌组分析采用566-F和1289-R引物对靶向18S小亚基核糖体RNA（18S rRNA），经两阶段PCR扩增后在Flongle R10.4.1流动池上进行牛津纳米孔长读长测序。生物信息学流程包括MinKNOW碱基识别、FastQC质量评估、Porechop接头修剪、NanoFilt质量与长度过滤（Q10，500–1,000 bp）、Kraken2基于NCBI RefSeq Targeted Loci真菌18S rRNA数据库分类。仅保留至少达到属级分类的特征，并采用0.25%相对丰度阈值过滤。α多样性和β多样性分析在R软件中使用phyloseq包完成，β多样性采用Bray–Curtis相异度并经PERMANOVA检验（999次置换，配对样本内置换受限）。

三、研究结果

测序与读长处理： 共获得767,382条经接头修剪的读长，其中604,339条通过质量与长度过滤，603,012条经Kraken2分类，439,062条至少被分配至属级。经0.25%相对丰度过滤后保留428,555条读长，对应30份标本中的107个属级分类特征。

真菌群落组成： 在纲水平上，所有采样位点的真菌群落谱系均以 Tremellomycetes 和 Dothideomycetes 为主。Tremellomycetes 在母乳、口腔和阴道样本中占比最大，Dothideomycetes 在各位点均有显著贡献且在肛门和粪便样本中占比最大。皮肤样本呈现与其他位点不同的组成特征，马拉色菌纲（Malasseziomycetes）相对贡献较高。粪便样本呈现更为异质的纲水平谱系，Sordariomycetes、Pichiomycetes 和"其他"类别的贡献较大。

α多样性： 基于属级特征的α多样性分析（Observed丰富度、Chao1估计值和Shannon多样性指数）显示，不同生物样本类型间无显著差异，表明各分析组内单个样本的内部多样性（观察丰富度和均匀度）相似。

β多样性： 基于Bray–Curtis相异度的β多样性分析显示采样位点间存在显著差异（p = 0.014，R2 = 0.28，配对内受限置换；非受限p = 0.036），表明属级群落组成在不同组间存在差异。敏感性分析显示该位点相关差异对逐样本排除和移除最孤立观测值均稳健，但在逐配对排除测试中预期地出现效力下降，因此被解读为探索性的位点相关模式。

时间效应： 未稀化分析中，Observed特征数和Chao1估计值在产后6周均高于48–72小时（Observed p = 0.015；Chao1 p = 0.0035；Observed中位数：56 vs. 73；Chao1中位数：63.8 vs. 79.1），该差异在各丰度阈值下一致。然而该差异对测序深度不稳健：Observed丰富度与深度仅弱相关（Spearman rho = 0.18，p = 0.35），稀化至最低文库大小后差异不再显著（Observed p = 0.27，Chao1 p = 0.23）。Shannon多样性指数在时间点间无显著差异（p = 0.1）。β多样性分析未显示采样时间对整体群落结构的显著影响（R2 = 0.04，p = 0.29）。组间离散度同质性检验无显著差异。

四、讨论与结论

本初步研究对生命早期母体和新生儿生物位点的真菌DNA谱系提供了初步评估。尽管α多样性指标在各样本类型间大致相当，但β多样性分析揭示了位点相关的真菌群落组成差异，表明不同解剖生态位存在独特的真菌DNA谱系。关键发现是新生儿皮肤样本中马拉色菌纲和马拉色菌属占优势，这与既往将马拉色菌属识别为早期皮肤真菌组特征组分的研究一致。在剖宫产分娩的单例婴儿中，马拉色菌属分配读长较低，但因仅一例如此分娩，仅作为个体观察报告，不能推断分娩方式效应。粪便样本呈现更大的分类异质性，"其他"类别中低丰度真菌纲贡献较大，可能反映环境和饮食暴露、瞬时真菌DNA或低生物量样本中有限的分类分辨率。口腔和胃肠道相关样本也观察到不同的真菌谱系，但这些发现不应被解读为母-婴直接传播的证据，可能同样反映共享的环境、饮食或围产期暴露。研究中检测到的若干高丰度分配属（如Sugitazyma和Superstratomyces）对应于环境或植物相关真菌而非典型人类相关类群，可能源于数据库局限、环境暴露、瞬时DNA或实验室/试剂背景。纵向分析提示产后6周检测到的真菌类群数量增加，但该差异对测序深度敏感且稀化后不再显著，被解读为深度敏感的描述性观察而非确定的发展趋势。β多样性分析仅显示非显著的时间趋势，表明随时间推移可检测到更多真菌类群而优势群落结构基本稳定。

从方法学角度，长读长18S rRNA扩增子测序结合NCBI RefSeq Targeted Loci真菌18S rRNA参考数据库分类，为真菌DNA谱系表征提供了有价值的框架，但意外类群的识别凸显了该方法在人类真菌组研究中的局限。未来研究应受益于基于ITS1或ITS2的测序（使用UNITE数据库）、模拟群落、测序阴性对照及对临床或生物学意外类群的靶向验证。

研究存在多项局限：提取和PCR阴性对照未测序，无法识别或排除试剂和实验室来源的真菌DNA；基于长读长18S rRNA测序的谱系分析限于属级，未使用或正式验证种级分配，也未进行ITS确认；所有分配代表检测到的真菌DNA，不能作为活菌存在或已建立定植的证据；仅一例婴儿为剖宫产分娩，无法评估分娩方式效应；母婴样本共享属级分配时，研究设计无法确定其反映母体转移、共享环境暴露、实验室背景还是偶然因素。

综上所述，本初步研究提供了生命早期母体和新生儿生物位点真菌DNA谱系的初步表征，证明了使用长读长18S rRNA测序从低生物量临床标本进行多位点真菌分析的可行性和当前局限。在该约束下，新生儿皮肤中马拉色菌属分配读长的优势表明真菌DNA谱系随解剖生态位而变化，且可检测丰富度在生命最初几周内似乎增加，尽管该发现对测序深度不稳健。该初步研究在两个层面作出贡献：提供了内部一致、与文献相符的早期生命真菌DNA谱系描述性基线（最显著的是新生儿皮肤中马拉色菌属优势）；方法学上界定了多位点18S谱系分析在低生物量母体和新生儿标本中何处具有信息价值、何处不具有，为未来人类真菌组研究提供实用指导。在此基础上，为纳入ITS测序、菌株水平分辨率、功能分析和测序技术对照的大型纵向研究建立了工作流程和可检验假设。