《Frontiers in Immunology》：Immune activation during liver machine perfusion is shaped by perfusate composition and is independent of the ischemic injury
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背景： 缺血再灌注损伤（ischemia–reperfusion injury, IRI）仍是肝移植中的重大挑战，在导致移植物衰竭的病理生理过程中发挥关键作用。机器灌注（machine perfusion, MP）是修复边缘供肝的一种有前景的方法
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背景： 缺血再灌注损伤（ischemia–reperfusion injury, IRI）仍是肝移植中的重大挑战，在导致移植物衰竭的病理生理过程中发挥关键作用。机器灌注（machine perfusion, MP）是修复边缘供肝的一种有前景的方法。然而，MP对固有免疫的影响仍缺乏充分定义。研究人员假设MP激活固有炎症反应。因此，研究人员研究了缺血性损伤和灌注液成分[富血浆灌注液（plasma-rich perfusate, PRP）与贫血浆灌注液（plasma-poor perfusate, PPP）]是否调节炎症反应，并通过补体激活和细胞因子释放加以识别。
方法： 30个猪肝脏接受了离体（ex situ）MP。前24个猪肝脏分别接受诱导性胆道缺血损伤（BileINJ，n = 8）、全肝缺血损伤（GlobalINJ，n = 8）或无诱导缺血损伤（CTRL，n = 8），MP期间使用PRP。随后6个猪肝脏接受相同的离体MP方案，使用PPP（n = 6）且无诱导缺血损伤。MP分三个阶段进行：1小时低温灌注、1小时控制性复温、4小时常温灌注。
结果： 除BileINJ组胆道组织中白细胞介素-1β（IL-1β）和GlobalINJ组血浆中肿瘤坏死因子（TNF）外，所有评估的介质——无论是在灌注液、肝脏还是胆道组织中——在缺血损伤组与CTRL组之间均无显著差异。因此数据合并为一个共同的PRP组用于进一步比较。在PRP灌注液中，MP诱导了强烈的补体激活（sC5b-9：中位倍数变化（FC）4 [2–6四分位距]）和细胞因子释放（IL-1β：FC 88 [51–165]，IL-6：FC 1,549 [587–3,053]，IL-8：FC 389 [120–1,259]，IL-10：FC 404 [222–656]，均p < 0.001）。这一模式在PPP组灌注液、肝脏和胆道组织中持续存在，但浓度显著低于PRP组（sC5b-9、IL-10、IL-6、IL-1β和IL-8，均p < 0.05）。
结论： 肝脏MP可靠地诱导固有免疫驱动的炎症，与先前缺血性损伤无关。PPP组炎症反应的幅度显著低于PRP组。未来针对离体MP期间固有免疫的治疗性试验对于改善肝移植物保存是必要的。
论文解读文章
一、研究背景与问题
缺血再灌注损伤（ischemia–reperfusion injury, IRI）仍是肝移植成功的主要障碍，通过促进短期和长期移植物衰竭的病理生理过程而发挥作用。IRI被认为是通过固有免疫系统的激活介导的，尤其是补体系统。为应对器官短缺，扩大标准供体和循环死亡后捐献器官的利用进一步增加了对IRI的易感性。机器灌注（machine perfusion, MP）已显示出减少IRI和提高器官利用率的潜力。然而，尽管在MP后发现多达20%原本被丢弃的肝脏具有活力，许多移植物在MP期间仍未能恢复功能。研究人员推测这可能归因于MP期间的炎症反应影响移植物功能，但固有免疫在此过程中的机制作用仍缺乏明确定义。补体系统是固有免疫的关键组成部分，其三条激活通路——经典、凝集素和替代通路——汇聚于C3水平，最终将C5裂解为强效过敏毒素C5a和末端补体复合物（terminal complement complex, TCC），后者以膜插入形式（C5b-9，膜攻击复合物）或可溶性形式（sC5b-9）释放。在移植和IRI中，凝集素和替代通路尤为激活。补体激活在体外循环系统如体外膜氧合、体外循环和血液透析中已有充分记录。类似地，肾脏常温机器灌注（normothermic machine perfusion, NMP）可诱导补体激活和细胞因子释放，但肝脏MP中的可比数据仍然有限。
鉴于补体系统在IRI中的关键作用，在MP期间调节其活性可能增强移植物保存和功能。因此，该研究的主要目的是研究遭受不同缺血损伤的猪肝脏中的补体激活和下游细胞因子释放。次要目的是评估灌注液成分对MP期间免疫激活的影响，确定减少免疫激活和改善肝移植结局的潜在策略。
二、研究内容与主要结论
该研究共纳入30个猪肝脏进行离体（ex situ）MP。前24个猪肝脏使用富血浆灌注液（plasma-rich perfusate, PRP），分为三组：对照组（CTRL，n = 8）、胆道缺血损伤组（BileINJ，n = 8）和全肝缺血损伤组（GlobalINJ，n = 8）。随后6个猪肝脏使用贫血浆灌注液（plasma-poor perfusate, PPP），无诱导缺血损伤。MP按Groningen方案分三个阶段进行：1小时双低温氧合机器灌注（DHOPE，8–10°C）、1小时控制性氧合复温（COR，升至猪正常体温38°C）和4小时常温机器灌注（NMP，38°C）。PRP组在复温和NMP期间使用肝素化、白细胞和血小板去除的自体全血；PPP组则将去除白细胞和血小板的全血经两次离心和磷酸盐缓冲液洗涤，仅保留红细胞。
研究发现，除BileINJ组胆道组织IL-1β和GlobalINJ组血浆TNF外，所有评估的介质在缺血损伤组与CTRL组之间无显著差异，因此合并为共同PRP组。在PRP组中，MP诱导了强烈的补体激活（sC5b-9中位FC 4）和细胞因子释放（IL-1β FC 88、IL-6 FC 1,549、IL-8 FC 389、IL-10 FC 404，均p < 0.001）。PPP组虽然也表现出类似的激活模式，但浓度显著低于PRP组。研究结论为：肝脏MP可靠地诱导固有免疫驱动的炎症，与先前缺血性损伤无关；PPP可显著降低炎症反应幅度，但仍存在一定程度的免疫激活，提示肝脏本身在再灌注损伤中发挥关键作用。
三、主要技术方法
研究人员使用了以下关键技术方法：（1）猪肝脏离体机器灌注模型，采用Groningen三阶段方案（低温灌注、控制性复温、常温灌注），使用Liver Assist设备；（2）自建酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测EDTA灌注液和微透析液中的C3a以及灌注液、肝脏和胆道组织中的sC5b-9，并针对猪进行了改良；（3）商业ELISA和多重检测试剂盒检测灌注液和组织中的细胞因子（TNF、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10）；（4）微透析导管（CMA 70，截留分子量100 kDa）插入肝组织、胆总管和肝门板，用于局部补体激活产物C3a的连续监测；（5）非参数统计方法（混合效应模型、Wilcoxon配对符号秩检验）进行组间和时间点比较。样本来源为挪威长白猪（Norwegian Landrace pigs），共30头，实验方案经挪威食品安全局批准（FOTS 24454）。
四、研究结果
3.1 缺血损伤肝脏MP期间的补体激活
灌注液、肝脏和胆道组织中的sC5b-9以及灌注液和微透析液中的C3a在PRP各损伤组间无显著差异，故合并分析。灌注液sC5b-9在NMP结束时（6小时MP）显著高于NMP开始时（2小时MP，峰值中位FC 1.6 [1.4–3.1]，p < 0.001）。胆道组织sC5b-9在6小时MP时较基线显著升高（FC 1.4 [0.9–1.8]，p = 0.004）。灌注液C3a在NMP期间无显著变化，但在复温开始（1小时MP）至NMP开始（2小时MP）期间显著下降（p < 0.001）。肝门板微透析液C3a在NMP开始和结束时（2和6小时）较低温MP开始时（0小时）显著升高（均p < 0.001）。胆汁微透析液C3a在复温期间（1和2小时MP）较0小时显著升高（均p < 0.001）。
3.1.1 缺血损伤肝脏MP期间的细胞因子释放
所有灌注液细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10）在6小时MP时较2小时MP显著升高（IL-1β FC 44 [17–63]、IL-6 FC 648 [207–1,545]、IL-8 FC 216 [67–653]、IL-10 FC 314 [105–527]，均p < 0.001）。GlobalINJ组灌注液TNF在整个MP过程中显著低于CTRL组（p = 0.02），但各组在NMP结束时均较开始时显著升高（均p < 0.02）。肝脏组织中除IL-10外，所有细胞因子在6小时较2小时显著升高（IL-1β FC 6 [4–9]、IL-6 FC 321 [141–739]、TNF FC 13 [6–22]、IL-8 FC 20 [5–45]，均p < 0.02）；肝脏组织IL-10显著下降（FC 0.8 [0.6–1.0]，p < 0.01）。胆道组织中IL-6、TNF和IL-8在6小时MP时较基线显著升高（IL-6 FC 19 [12–72]、TNF FC 22 [6–44]、IL-8 FC 282 [105–564]，均p < 0.001）。BileINJ组胆道组织IL-1β在6小时MP时显著低于CTRL组（p = 0.001），但各组均较基线显著升高（均p < 0.002）。
3.1.2 PPP与PRP在MP期间的补体激活比较
PPP组灌注液、肝脏和胆道组织中的sC5b-9在整个MP期间均显著低于PRP组（均p < 0.04）。PPP组内灌注液sC5b-9在6小时MP时较2小时显著升高（p < 0.05）。
3.1.3 PPP与PRP在MP期间的细胞因子释放比较
PPP组灌注液IL-1β、IL-6和IL-10在MP期间（1、4或6小时）显著低于PRP组（p < 0.05）；TNF和IL-8在两组间无显著差异。PPP组内灌注液IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10在6小时较2小时显著升高（均p < 0.04），TNF无显著变化。PPP组肝脏组织IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10在MP期间显著低于PRP组（均p < 0.04），TNF无显著差异。PPP组内肝脏组织IL-1β和IL-6在6小时较2小时显著升高（均p < 0.04），IL-8和IL-10在0小时至6小时显著升高（均p < 0.04）。PPP组胆道组织所有细胞因子在6小时MP时均显著低于PRP组（均p < 0.05）。PPP组内胆道组织IL-1β、IL-6、TNF和IL-8在6小时较基线显著升高（均p < 0.04），IL-10无显著变化。
五、讨论与结论
讨论部分指出，除灌注液TNF和胆道组织IL-1β外，PRP组中观察到的损伤无关性补体激活和细胞因子释放模式可能归因于器官获取（温缺血）、保存（冷缺血）和MP本身所共同引发的IRI炎症反应。sC5b-9在MP期间持续升高，与肾脏MP研究一致，部分可能源于MP回路的生物不相容性，即血液与异物表面和气血界面的接触触发补体激活。灌注液C3a在复温开始时达峰，可能源于全血过滤后的补体激活，随后因短半衰期而下降；而微透析液中C3a在MP期间升高，提示其可能作为缺血性肝和胆道损伤的标志物。细胞因子在NMP 2至4小时之间达峰，表明活跃代谢是细胞因子产生的先决条件。在白细胞和血小板去除的灌注液模型中，肝内常驻细胞（如Kupffer细胞、肝细胞和胆道上皮细胞）是细胞因子的可能来源。PPP组sC5b-9和细胞因子显著低于PRP组，但仍在升高，鉴于肝脏合成高达90%的循环补体蛋白，这提示肝脏本身在MP期间主动参与炎症环境的形成。研究还讨论了灌注液TNF在GlobalINJ组中降低的独特模式，可能与TNF受体家族信号机制不同于经典白细胞介素通路有关。已有研究表明灌注液IL-6和IL-10水平与肝移植后移植物丢失和重症监护时间相关，提示补体和细胞因子可作为候选生物标志物。研究建议未来应使用PPP，并探索针对固有免疫的干预措施（如C3或C5与CD14双重抑制）以减少再灌注损伤的有害效应。
结论： 对补体激活产物和下游细胞因子释放的免疫学分析揭示了在有无诱导缺血损伤的肝脏MP期间均存在固有免疫系统激活。灌注液中的血浆决定了炎症的幅度，尽管PPP仍导致炎症，这暗示肝脏本身在再灌注损伤中发挥关键作用。未来研究应使用PPP，并应进一步研究针对固有免疫系统的干预措施，以减少再灌注损伤的有害效应，以期增加可移植器官的数量。
