餐桌橄榄发酵相关植物乳植杆菌菌株的比较功能基因组学分析

《Frontiers in Bioinformatics》：Comparative functional genomic analysis of table olive-associated Lactiplantibacillus plantarum strains

　　

专业摘要翻译： 餐桌橄榄是地中海地区最重要的发酵蔬菜之一，其发酵过程主要由乳植杆菌属（Lactiplantibacillus）物种驱动。虽然戊糖乳植杆菌（Lactiplantibacillus pentosus）已在基因组水平上得到广泛研究，但橄榄相关植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）的基因组信息仍然匮乏。为拓展现有知识，研究人员对分离自西班牙（Lpl15和LPT703）和希腊（B282）餐桌橄榄发酵体系的三株新型植物乳植杆菌菌株进行了全基因组测序和比较基因组学分析。基因组组装大小介于3.25至3.50 Mb之间，包含3,060至3,328个预测蛋白编码基因。虽然Illumina组装仍呈碎片化，但杂交测序获得了菌株植物乳植杆菌Lpl15的完整基因组组装，包括一条完整染色体和三个质粒。研究整合了来自不同生态起源（包括蔬菜发酵、动物源食品和人类相关环境）的植物乳植杆菌基因组进行比较分析，采用平均核苷酸一致性（Average Nucleotide Identity，ANI）、泛基因组分析和核心基因组系统发育分析。ANI和系统发育组学分析均不支持存在与餐桌橄榄发酵相关的独特谱系。功能和代谢比较揭示了两个与生态起源相关的主要基因组群。主要与蔬菜发酵相关的基因组缺乏完整的氮代谢途径，而动物来源菌株通常保留这些功能。此外，蔬菜相关菌株在胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）生物合成相关基因方面呈现富集。蛋白家族、结构域和可移动元件相关分析进一步揭示了与生态位相关的基因组模式。总体而言，这些结果表明，来自餐桌橄榄发酵的植物乳植杆菌并不构成独特的进化谱系。相反，适应性似乎反映在与生态起源相关的功能和辅助基因组特征中，为该物种在不同环境中的多样性和适应潜力提供了新见解。

论文解读文章：

研究背景与问题

餐桌橄榄是地中海地区消费最广泛的发酵蔬菜之一，2024/2025年度全球产量超过300万吨。其发酵是由乳植杆菌属物种主导的复杂微生物过程，其中戊糖乳植杆菌和植物乳植杆菌贡献最为突出。这些细菌不仅促进酸化并维持产品稳定性，还影响感官品质、食品安全和发酵橄榄的功能特性。目前，超过40株橄榄来源的戊糖乳植杆菌基因组已在公共数据库中可用，相关研究为其遗传多样性、发酵环境适应性和技术潜力提供了重要见解。然而，尽管植物乳植杆菌具有重要的生态和技术相关性，其在餐桌橄榄发酵中的基因组研究仍然稀缺，目前仅有四株橄榄相关植物乳植杆菌的完整基因组公开可用。下一代测序技术的进步使全基因组测序能够全面揭示基因组组织、代谢潜力、适应机制等功能相关特征，为理解微生物生态和优化传统发酵工艺提供了基础。基于此，研究人员开展了本研究，旨在扩展橄榄相关植物乳植杆菌的基因组信息，阐明其遗传多样性、功能和技术能力及对发酵环境的适应机制。

研究内容与主要结论

研究人员对分离自西班牙和希腊餐桌橄榄发酵体系的三株新型植物乳植杆菌菌株（Lpl15、B282和LPT703）进行了全基因组测序和比较基因组学分析，并与来自不同生态起源的32株公开基因组进行了系统比较。结果表明，植物乳植杆菌来自餐桌橄榄发酵的菌株不构成独特的进化谱系，适应性主要体现在与生态起源相关的功能和辅助基因组特征上。短读长组装在功能注释方面与杂交组装相当，但长读长测序显著提高了重复区域的解析能力，实现了对质粒、基因组岛和插入序列等可移动元件的更精确表征。比较基因组分析揭示了不同生态起源菌株间高度保守的核心基因组，未发现生态位特异的系统发育谱系，而生态起源相关的差异主要存在于辅助基因组中，涉及代谢功能、碳水化合物活性酶谱、防御系统和可移动遗传元件。

主要技术方法

研究人员采用了多种关键技术方法。三株菌株分别通过Illumina平台测序，其中Lpl15额外进行了Oxford Nanopore Technologies长读长测序。基因组组装使用SPAdes和Unicycler，质量评估采用CheckM和BUSCO。比较分析方面，研究人员构建了包含35株植物乳植杆菌基因组的比较数据集，来源涵盖蔬菜发酵（餐桌橄榄、泡菜、酸菜和腌黄瓜）、乳制品、肉制品和人类微生物群。分析手段包括平均核苷酸一致性分析、泛基因组分析（Panaroo）、核心基因组系统发育重建（IQ-TREE2）、KEGG代谢途径完整性分析（KEGGDecoder）、碳水化合物活性酶预测（dbCAN）、蛋白家族和结构域注释（Pfam）以及主成分分析和随机森林分析。此外，还进行了防御系统鉴定（CRISPRCasFinder、DefenseFinder）、可移动元件表征（RFPlasmid、IslandViewer4、IntegronFinder、PHASTEST、ISEScan）和基因组安全性评估（CARD、ResFinder、PathogenFinder、VirulenceFinder）。

研究结果

测序与基因组组装比较

Illumina测序为所有菌株生成了高质量数据，而Lpl15的Oxford Nanopore测序提供了平均长度10.8 kb的长读长。杂交组装使Lpl15获得了包含一条完整染色体和三个质粒的完整基因组，而B282和LPT703的短读长组装分别包含42和22个重叠群。基因组大小介于3.20至3.45 Mb之间，GC含量为44.17%至44.43%。BUSCO分析在所有组装中恢复了全部保守细菌和乳杆菌目直系同源基因，确认基因组接近完整。基因组比对显示菌株间整体染色体共线性，但短读长组装碎片化程度更高。Prokka注释预测B282、Lpl15和LPT703分别含有3,328、3,282和3,060个编码序列。功能注释显示转录、翻译和碳水化合物转运与代谢是最具代表性的COG功能类别，而细胞运动性、次级代谢物生物合成和细胞周期控制最为稀少。BAGEL5在三株菌株基因组中均预测到对应于plantaricin J的单一II类细菌素基因簇。胞外多糖位点分析在B282和LPT703中鉴定到两个完整EPS生物合成簇，而Lpl15仅含有一个与另外两株菌中一个位点具有相同遗传组织的簇。

防御机制与可移动元件分析

CRISPR-Cas系统在三株菌株基因组中基本缺失，仅B282含有不完整的I型cas基因簇。所有菌株中均鉴定到替代防御机制，包括AbiD、BREX、CBASS、MazEF、限制修饰系统和Septu系统。B282展现出最多样的防御库，含有五种不同防御系统，而Lpl15仅含有一个预测防御系统，LPT703含有三种。由于短读长组装的碎片化特性，B282和LPT703的质粒和基因组岛数量无法可靠确定。Lpl15的完整杂交组装揭示了三个质粒（长度分别为69,974 bp、57,072 bp和3,424 bp）和三个基因组岛。质粒BLAST比对显示，两个较大质粒与植物乳植杆菌菌株中已鉴定的质粒具有最高相似性，而最小质粒与乳酪杆菌属物种的质粒相似性更高，提示可能存在水平基因转移。三株菌株中均未检测到整合子。短读长组装中预测的插入序列为5至7个，而Lpl15杂交组装中鉴定到16个。B282和Lpl15各含有三个完整前噬菌体，而LPT703仅检测到一个。

基因组安全性评估

所有基因组中均未检测到获得性抗生素耐药、消毒剂耐药、毒力或致病性相关基因。CARD虽鉴定到万古霉素耐药决定因子，但对应乳杆菌中常见的固有耐药性。总体结果支持三株菌株的基因组安全性。

ANI、泛基因组分析与系统发育关系

35株植物乳植杆菌基因组的ANI分析确认了其物种分类学归属，成对核苷酸一致性范围为98.25%至99.99%。泛基因组分析鉴定到6,480个基因簇，包括2,351个核心基因簇和4,129个辅助基因簇。基于核心基因组比对的最大似然系统发育树显示，不同生态起源的菌株总体呈混合分布，未观察到按分离来源的清晰聚类。然而，分离自黄瓜和酸菜发酵的菌株形成了与其余植物乳植杆菌基因组明显分离的独特谱系。

跨生态起源的比较代谢途径与CAZyme分析

KEGG分析鉴定到62条代谢途径，其中35条在所有基因组中完整，27条完整性水平各异。基于途径完整性的层次聚类揭示了两个主要基因组群：一个以蔬菜发酵来源菌株为主，另一个主要包含动物相关来源菌株。最显著差异在于蔬菜相关菌株群缺乏完整的氮代谢途径，特别是亚硝酸盐氧化和异化硝酸盐还原途径。共鉴定到57个CAZy家族，包括28个糖苷水解酶、19个糖基转移酶、4个碳水化合物酯酶、3个碳水化合物结合模块和3个辅助活性家族。基于CAZyme谱的层次聚类将基因组分为三个主要簇，分别以植物相关、动物相关或混合生态起源为主。差异富集分析鉴定出GT125、GH31_15、GH20、GH92和GH125在特定簇中显著富集。植物相关簇中GT125富集与胞外多糖生物合成相关，动物相关簇中GH31_15（α-葡萄糖苷酶）富集可能参与更特化的碳水化合物底物利用。Pfam注释鉴定到2,284个蛋白家族和结构域，经方差过滤后保留300个进行下游分析。主成分分析显示前两个主成分解释了约30%的总方差。随机森林分析鉴定出与生态起源判别最相关的Pfam结构域，功能分类显示这些结构域主要涉及黏附、防御系统、可移动遗传元件、前噬菌体和限制修饰系统。

讨论与结论

讨论部分指出，短读长与杂交组装在可移动元件解析方面存在重要差异。防御系统可独立于组装策略可靠鉴定，而质粒、基因组岛和插入序列的准确表征强烈依赖于组装连续性，这源于这些元件的重复性质及其频繁出现在组装断点处。前噬菌体预测受组装碎片化影响较小，因其通常作为较大且连续的染色体区域存在。ANI和系统发育分析揭示了植物乳植杆菌基因组的高度保守性，未观察到按生态起源的清晰聚类，结合辅助基因组的大规模特征，表明该物种的生态多样化主要与辅助遗传内容变异相关，而非核心基因组的分歧。KEGG和CAZyme分析均提示存在与生态起源相关的功能趋势，但这些模式不足以建立生态位特异特征或明确将基因组分配到特定栖息地，而是反映了植物和动物来源环境相关菌株群之间代谢潜力的渐变。Pfam结构域分析中移动元件和防御相关结构域的主导地位表明，这些基因组区域可能在塑造植物乳植杆菌种群功能多样性中发挥核心作用。研究结论为：短读长组装提供的功能注释与杂交组装相当，但长读长测序显著改善了重复区域的解析并实现了对植物乳植杆菌可移动元件的更准确表征。比较基因组分析揭示了不同生态起源菌株间高度保守的核心基因组，未发现生态位特异的系统发育谱系，而生态起源相关差异主要存在于辅助基因组中。这些发现进一步支持了植物乳植杆菌的生态分化主要由辅助基因组变异驱动而非核心基因组分歧的观点。此外，三株新测序菌株中鉴定到的基因组特征为未来探索其技术和益生菌潜力提供了宝贵基础。