《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：The phenotypic heterogeneity of tumor-derived cells in the bloodstream of pancreatic cancer patients
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摘要专业翻译
引言： 胰腺癌（pancreatic cancer, PC）仍是一种侵袭性极强的恶性肿瘤，临床预后较差，亟需新型生物标志物用于患者监测。免疫检查点分子[程序性死亡配体1（programmed death ligand 1, PD-L1）和细胞毒性
摘要专业翻译
引言： 胰腺癌（pancreatic cancer, PC）仍是一种侵袭性极强的恶性肿瘤，临床预后较差，亟需新型生物标志物用于患者监测。免疫检查点分子[程序性死亡配体1（programmed death ligand 1, PD-L1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CTLA-4）]已在循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTCs）中被检测到，其表达与不良预后相关。STIM1和ORAI1（钙信号核心调控因子）以及氨基酸转运体伴侣蛋白CD98hc的过表达已被证明可增强癌细胞存活和迁移能力。本研究评估了上述分子在胰腺癌循环肿瘤细胞（PC-CTCs）中的表达，同时检测细胞角蛋白（cytokeratin, CK，肿瘤细胞标志物）和CD45（泛白细胞标志物）。
方法： 研究人员采用Ficoll密度梯度离心法从40例患者中分离CTCs，并通过免疫荧光进行表征。此外，15例患者样本使用ISET平台进行分析。同时评估了10例健康供者（healthy donors）的外周血单个核细胞（PBMCs）。生物标志物表达采用自动化VyCAP平台评估，随后通过ACCEPT软件进行评价，并结合辅助临床数据进行统计分析。
结果： 20%的患者中检测到CTCs，而所有患者均显示存在（CK-/CD45-）且细胞核大小≥10 μm的具有肿瘤特征的细胞，被命名为循环肿瘤相关细胞（circulating tumor-associated cells, CTACs）。与健康供者相比，患者中CTACs显著升高，ROC分析显示其具有较强的区分能力（AUC = 0.9083）。同样，使用ISET平台，CTCs在26.7%（4/15）的患者中检测到，而CTACs在93.3%（14/15）的患者中检测到。PD-L1阳性CTCs在2.5%的患者中被识别，而CTACs上PD-L1和CTLA-4的表达分别在30%和17.5%的患者中检测到。STIM1阳性和ORAI1阳性CTCs分别在15%和2.5%的患者中观察到，而其在CTACs上的表达分别在70%和10%的患者中检测到。关于CD98hc，32.5%的患者携带（CD98hc+/CD45-）细胞。值得注意的是，携带PD-L1阳性CTCs的转移性患者表现出更短的总生存期（overall survival, OS；p = 0.025），而在1年内进展的患者中，存在≥2个（CD98hc+/CD45-）细胞与更短的无进展生存期（progression-free survival, PFS；p = 0.007）相关。相反，STIM1阳性CTCs的存在与更好的OS相关（p = 0.021）。
讨论： 这些发现利用与钙信号和免疫检查点通路相关的多重生物标志物组合，对PC中的CTCs和CTACs进行了全面表征，突显了这些循环细胞群体显著的异质性及潜在的临床相关性。
论文解读
一、研究背景与科学问题
胰腺癌是一种侵袭性极强的恶性肿瘤，起病隐匿，多数患者确诊时已处于晚期，预后极差。传统的组织活检在胰腺癌的疾病监测中面临诸多困难，包括取样困难、创伤性大以及难以反复进行。液体活检作为一种微创的创新手段，能够实时提供疾病进展和药效学方面的临床重要信息，而循环肿瘤细胞（CTCs）作为液体活检的核心组成部分，在肿瘤转移监测和预后评估中具有重要价值。
然而，在胰腺癌患者中利用传统上皮标志物识别CTCs面临显著挑战。经历上皮-间质转化（EMT）的CTCs会丢失EpCAM和细胞角蛋白（CKs）等上皮标志物的表达，导致检测到（CK-/CD45-）或（EpCAM-/CD45-）等非典型循环细胞群体。这些细胞常表现出间质特征，可能代表EMT相关CTCs以及循环肿瘤相关成纤维细胞（cCAFs）等非造血性肿瘤相关细胞类型，进一步增加了CTCs表征的复杂性，并导致对真实肿瘤负荷的低估。
既往研究表明，免疫检查点分子PD-L1和CTLA-4在肿瘤细胞和CTCs中频繁上调，对不同类型癌症具有重要预后价值。钙稳态是癌症生物学中控制肿瘤细胞存活的另一重要轴心，癌细胞主要通过由STIM1和ORAI1调控的钙库操控性钙内流（SOCE）维持稳定的钙摄取。此外，癌细胞过表达CD98重链（SLC3A2/CD98hc），该分子是L型氨基酸转运体的关键伴侣蛋白，同时介导β-整合素信号传导，促进肿瘤细胞运动和侵袭。鉴于胰腺癌的侵袭性及现有生物标志物的局限性，开展本研究旨在基于免疫检查点分子和钙信号相关蛋白，全面表征胰腺癌患者CTCs和CTACs群体的异质性，并探索这些生物标志物在疾病监测中的潜在临床意义。
二、研究设计与主要技术方法
本研究共纳入40例未经治疗的胰腺癌患者和10例健康供者（作为对照组），所有参与者均签署书面知情同意书。研究人员采用以下关键技术方法开展研究：
Ficoll密度梯度离心法从外周血中分离外周血单个核细胞（PBMCs），CTCs与PBMCs共同存在于分离环中；ISET微滤平台基于细胞尺寸进行CTC分离，用于15例患者的平行验证；双色和三色免疫荧光染色技术，使用针对CK、CD45、CTLA-4、PD-L1、STIM1、ORAI1和CD98hc的特异性抗体对细胞涂片和ISET膜样本进行染色；VyCAP自动化成像系统进行样本图像采集，随后使用开源ACCEPT软件进行验证和CTACs识别；MIA PaCa-2和MDA-MB-231细胞系作为阳性对照，通过将癌细胞掺入健康供者PBMCs模拟CTC条件；统计学分析采用SPSS和GraphPad Prism软件，包括Kaplan-Meier生存分析、Cox回归分析、ROC曲线分析、Wilcoxon符号秩检验、Mann-Whitney U检验、Spearman秩相关系数和McNemar检验。
三、主要研究结果
3.1 胰腺癌患者肿瘤来源循环细胞的表型可塑性
在所有染色实验中，CTCs仅在20%的患者中检测到，而所有患者均显示存在（CK-/CD45-）且细胞核大小≥10 μm的细胞，被命名为循环肿瘤相关细胞（CTACs）。CTACs的平均计数显著高于CTCs（p < 0.0001）。患者中CTACs数量[中位数4.875（范围1–41.5）]显著高于健康供者[中位数1（范围0–4）]（p < 0.0001）。ROC分析显示CTACs计数区分胰腺癌患者与健康供者的AUC为0.9038（95% CI: 0.80–1.000，p < 0.0001）。基于健康供者上限，患者被分类为CTAC阳性（>4个CTACs）。Cox回归分析显示，CTAC阳性转移性患者的OS更差（log-rank p = 0.03，HR = 1.26，95% CI: 1.02–1.54）。使用ISET平台，CTCs在26.7%（4/15）的患者中检测到，而CTACs在93.3%（14/15）的患者中检测到。
3.2 胰腺癌患者CTCs和CTACs的表型特征
3.2.1 免疫检查点标志物表达
在（CK/PD-L1/CD45）染色中，CTCs仅在8%（3/40）的患者中检测到，而CTACs在80%（32/40）的患者中被识别。在CK阳性患者中，33%（1/3）携带（CK+/PD-L1+/CD45-）表型。在CTAC阳性患者组（>4 CTACs）中，36%（8/22）携带PD-L1阳性CTACs，而（CK-/PD-L1-/CD45-）表型存在于91%（20/22）的患者中。转移性患者中PD-L1阳性CTACs的检出率（55%，6/11）高于非转移性患者（20%，2/10）。在（CK/CTLA-4/CD45）染色中，未检测到CTCs，85%（34/40）的患者有可检测的CTACs。在CTAC阳性患者中，（CK-/CTLA-4+/CD45-）表型在18%（4/22）的患者中观察到。
3.2.2 免疫检查点分子表达的临床意义
Kaplan-Meier分析显示，携带PD-L1阳性CTCs的转移性患者OS显著缩短（1.00个月 vs. 6.00个月；log-rank p = 0.025）。Cox回归分析显示相似趋势（HR = 9.163，95% CI: 0.83–101.07），但未达到统计学显著性（p = 0.071）。
3.2.3 钙信号生物标志物表达
在（CK/STIM1/CD45）染色中，CTCs仅在15%（6/40）的患者中检测到，所有CTC阳性患者（100%，6/6）均携带（CK+/STIM1+/CD45-）表型。CTACs在95%（38/40）的患者中被确认。在CTAC阳性患者中，（CK-/STIM1+/CD45-）表型在77%（17/22）的患者中观察到。在（CK/ORAI1/CD45）染色中，仅1例患者检测到CTCs且均为ORAI1阳性，CTACs在83%（33/40）的患者中检测到。在CTAC阳性患者中，仅9%（2/22）显示（CK-/ORAI1+/CD45-）表型。STIM1阳性CTCs与ORAI1阳性CTCs（rho = 0.348，p = 0.028）及ORAI1阳性CTACs（rho = 0.504，p < 0.001）呈正相关。
3.2.4 CD98hc表达
由于胰腺癌患者CTCs中CK表达率低，研究人员使用CD98hc作为潜在生物标志物，与CD45和形态学标准结合。在（CD98hc/CD45）染色中，43%（13/30）的患者表现出（CD98hc+/CD45-）细胞，而（CD98hc-/CD45-）细胞显著更常见（93%，28/30；p < 0.0001）。非转移性患者中（CD98hc+/CD45-）细胞检出率为50%（6/12），转移性患者为35%（6/17）。
3.2.5 钙信号相关分子的临床意义
携带STIM1阳性CTCs的患者OS显著优于无此表型的患者（15个月 vs. 6个月；log-rank p = 0.021）。Cox回归分析显示相似趋势（HR = 0.164，95% CI: 0.019–1.088），但未达统计学显著性（p = 0.06）。在1年内疾病进展（PFS ≤ 12个月）的患者亚组中，存在≥2个（CD98hc+/CD45-）细胞与更短的PFS显著相关（3个月 vs. 12个月；log-rank p = 0.007）。Cox回归分析在该亚组中确认了PFS的显著差异（p = 0.036，HR = 13.6，95% CI: 1.19–156.41）。
四、讨论与结论总结
讨论部分指出，胰腺癌的CTC检测因肿瘤异质性而面临挑战，EMT导致上皮标志物丢失，仅依赖上皮标志物可能低估肿瘤负荷。本研究中CTACs在所有染色实验中均以高于CTCs的比例被检测到，且在患者中显著富集，ROC分析证实其良好的区分能力，CTACs高计数与转移性患者更差的OS相关，支持这些亚群的潜在生物学相关性。
关于免疫检查点分子，PD-L1和CTLA-4在CTCs中的表达较低或缺失，但CTACs表现出更高的阳性率。转移性患者中PD-L1阳性CTCs与更差OS相关，而CTACs上PD-L1表达在转移性患者中更常见，提示PD-1/PD-L1或CTLA-4通路的弱且不一致的激活，可能反映免疫检查点抑制剂在该疾病中疗效有限。
STIM1在CTACs中高频表达，与PDAC中STIM1敲低可逆转EMT的证据一致。STIM1阳性CTCs与更好的OS相关这一看似矛盾的结果，可能反映STIM1的上下文依赖性作用，研究人员推测循环中氧化和机械应激环境可能导致STIM1介导的钙超载触发细胞死亡，使STIM1阳性CTCs在循环或转移微环境中存活能力降低。
CD98hc阳性癌细胞在43%的胰腺癌患者中检测到，与既往组织学研究一致。存在≥2个（CD98hc+/CD45-）细胞与1年内进展患者的更短PFS相关，提示CD98hc的预后价值。
研究结论指出，这是首次在胰腺癌患者中评估免疫检查点和钙信号分子组合在形态学和表型定义的肿瘤来源细胞中的表达并探索其预后意义的研究。CTACs是主要循环细胞亚群，强调了传统上皮标志物CTC检测的局限性。PD-L1、STIM1和CD98hc与不同的临床结局显著相关，观察到的表达模式提示与免疫检查点抑制剂耐药相关的机制，并涉及钙信号和氨基酸转运通路在CTC介导的疾病进展中的作用。
