《Frontiers in Immunology》：Integrated miR-omics and proteomics reveal the regulatory role of miR in protein networks associated with COVID-19 disease progression
编辑推荐：
摘要专业翻译
引言： 虽然microRNA（miR）表达谱分析已在COVID-19患者中识别出潜在的生物标志物，但miR调节疾病严重程度的调控机制仍未得到充分阐明。研究人员开展了整合性miR-蛋白质组分析，以阐明miR调控与COVID-19严重程度之间的机制性
摘要专业翻译
引言： 虽然microRNA（miR）表达谱分析已在COVID-19患者中识别出潜在的生物标志物，但miR调节疾病严重程度的调控机制仍未得到充分阐明。研究人员开展了整合性miR-蛋白质组分析，以阐明miR调控与COVID-19严重程度之间的机制性关联。
方法： 研究纳入93例急性COVID-19患者的去标识化血浆样本，采用12分症状评分系统按严重程度分组：轻度（0–1分）、中度（2–4分）和重度（5–12分）。研究人员运用单变量统计、通路分析、miR靶标预测和相关性分析对miR及蛋白质组学谱进行分析。在包含94例参与者的验证队列中，评估了原始队列三个严重程度组之间差异表达miRNA（DEMs）和差异表达蛋白（DEPs）。
结果： 研究人员在三种比较中识别出365个独特miR和801个独特蛋白与COVID-19严重程度显著相关。 ingenuity通路分析（IPA）显示，在重度与轻度病例比较中，中性粒细胞脱颗粒、细胞因子风暴、白细胞介素-10（IL-10）信号传导和伤口愈合信号传导是失调最显著的通路，其中IL-6参与10个最显著通路中的9个。对93例参与者的miR与蛋白进行相关性分析，识别出6,559对|r| > 0.5的miR-蛋白配对，其中83.6%呈负相关，提示miR介导的蛋白表达下调广泛存在。发现队列中122对预测miR-蛋白配对与验证队列中相同miR-蛋白配对之间存在显著相关性（r = 0.43，p < 0.0001）。
讨论： 据研究人员所知，这是首次对同一批COVID-19参与者的循环miR和蛋白进行整合分析，并在独立验证队列中分别验证。高频率的miR-蛋白负相关性结合靶标预测分析提示，miR在COVID-19严重程度相关通路中发挥调控作用。这些发现为miR调控宿主免疫应答提供了机制性见解，并识别出可为COVID-19治疗提供参考的潜在生物标志物。
论文解读
一、研究背景与科学问题
SARS-CoV-2感染及其引发的COVID-19疫情对全球造成了毁灭性影响，累计感染超过7.77亿例，死亡超过700万例。尽管疫情急性期已过，但该病毒持续构成重大健康挑战。年龄、性别及糖尿病、癌症、肥胖、高血压、哮喘和吸烟等基础疾病已被确认为COVID-19重症化的风险因素，但这些因素并不能完全解释患者反应的异质性。重症COVID-19的标志性特征是“细胞因子风暴”，即促炎细胞因子过度产生所导致的失调性免疫应答。既往研究分别对miRNA或血浆蛋白进行了分析，但关于miR如何调控疾病进展的机制仍存在显著认知空白。尽管多组学研究已开始揭示COVID-19应答的复杂性，但基于同一批个体的蛋白质组学与miR组学谱的综合整合仍然有限。为此，研究人员开展了首次在同一批SARS-CoV-2感染个体中同时进行循环miRNA和蛋白表达整合分析的研究，并在独立验证队列中加以验证，旨在发现预测COVID-19应答严重程度的生物标志物并阐明相关分子机制，为更有效的诊断、治疗和风险评估方法提供依据。
二、研究设计与技术方法
研究人员采用双队列验证设计开展研究。发现队列（UTHSC队列）纳入2020年8月至2022年7月间在田纳西州孟菲斯市招募的93例SARS-CoV-2 PCR阳性参与者，按改良WHO严重程度评分标准分为轻度（N=33）、中度（N=28）和重度（N=32）三组。验证队列（UAMS队列）纳入阿肯色大学医学科学中心收集的94例血浆样本，其中65例采用WHO评分标准分类，29例采用替代标准分类。主要技术方法包括：采用HTG EdgeSeq技术结合Illumina HiSeq 4000测序对2,083个miR进行表达谱分析；采用Olink Explore 3072邻近延伸分析技术对2,921种蛋白进行定量检测；运用SAS 9.4软件进行差异表达分析（DEMs以FC>2.0、p<0.05、CV<50%为阈值；DEPs以FC>1.5、p<0.05、CV<50%为阈值）；采用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）进行通路富集分析和miR靶标预测；运用Pearson相关分析评估miR-蛋白表达关联。
三、研究结果
3.1 患者人口统计学结果
发现队列中，重度与轻度组在年龄（52.2±19.0 vs 39.3±14.3岁，p=0.0032）和种族构成上存在显著差异，黑人占比在重度组显著更高（68.8% vs 9.1%，p<0.0001）。性别、基础疾病（糖尿病、高血压、心血管疾病、肥胖、慢性肾病或肺病）及疫苗接种状态在三组间无显著差异。验证队列中，年龄在重度与轻度、重度与中度比较中均为显著因素，而性别和种族在各组间无显著差异。
3.2 血浆miR和蛋白表达特征可区分COVID-19严重程度组
差异表达分析在发现数据集中识别出365个独特DEMs和801个独特DEPs。中度vs轻度比较中识别出84个DEMs（88%表达下调）；重度vs中度比较中识别出195个DEMs（84%表达上调）；重度vs轻度比较中识别出273个DEMs（54%下调、46%上调）。蛋白方面，中度vs轻度、重度vs中度和重度vs轻度比较分别识别出69、503和742个DEPs，后两组中约90%表达上调。Venn图分析显示15个miR和27个蛋白在三种比较的交集中，可作为COVID-19严重程度的潜在判别因子。已报道的严重程度标志物如miR-17-5p、miR-20a-5p、miR-106a-5p、miR-451a以及IL-6、HGF等蛋白均得到验证。与严重程度评分相关性分析显示，miR-150-5p（r=?0.62）为负相关最强的miR，AREG（r=0.71）、MAD1L1（r=0.73）、SDC1（r=0.73）和KRT19（r=0.71）为强正相关蛋白。
3.3 经典通路富集分析
IPA通路分析在重度vs轻度比较中识别出118条富集通路（?log10 p>2且|z-score|>2）。中性粒细胞脱颗粒为激活最显著的通路（z-score>6）。病原体诱导的细胞因子风暴信号通路是唯一在三种比较中均富集的通路，且显著性随严重程度递增（中度vs轻度：?log10 p=5.51，z=2.0；重度vs轻度：?log10 p=15.2，z=4.71；重度vs中度：?log10 p=14.6，z=3.45）。
3.4 IPA miR-蛋白靶标分析
IPA miR靶标过滤工具识别出18,313个miR-蛋白靶标关系，其中9,901对包含至少一个差异表达元件。经通路关联过滤后，构建了包含60个miR、58个蛋白和29条通路的122对miR-蛋白连接网络（Sankey图）。29条通路被归纳为四个生物学模块：细胞因子与先天免疫信号通路；慢性炎症、自身免疫与神经炎症通路；纤维化、器官病理与组织重塑通路；核心细胞信号与癌症生物学通路。IL-6蛋白出现在29条富集通路中的23条，且存在于全部四个模块中。大规模Pearson相关分析（363,300对）识别出6,559对|r|>0.5且FDR<0.05的显著相关miR-蛋白配对，其中约84%为负相关。IPA预测与相关性分析双重验证识别出9个miR（miR-21-5p、miR-23a-3p、miR-199a-5p、miR-26a-5p、miR-16-5p、miR-24-3p、miR-30d-5p、miR-29c-3p和miR-144-3p）和9个蛋白（ACTA2、CCL7、HGF、IL-15、JUN、LGALS9、TNFRSF10B、TNFRSF1A和SFRP1），这些分子均已被既往研究报道为COVID-19生物标志物。
3.5 UAMS验证队列
验证队列中，273个重度vs轻度DEMs中有221个（80.95%）保持显著，其中98.64%方向一致；742个重度vs轻度DEPs中有556个（74.93%）保持显著，全部方向一致。总体而言，365个独特DEMs中有249个、801个独特DEPs中有585个在验证队列中得到验证。13个DEPs（PINLYP、FDX1、GBP2、IL-1RL1、IL-6、MAD1L1、MYBPC1、MYL3、MYLPF、NADK、SFRP1、SMOC1和ZBTB16）在三种比较中均显著且方向一致。通路富集在验证队列中高度可重复，32条通路均达到?log10 p>3.0且z-score>2.0。122对miR-蛋白配对在两个队列间的相关性呈显著正相关（r=0.43，p<0.0001），平均相关系数分别为?0.334（发现队列）和?0.339（验证队列）。miR-30d-5p与TNFRSF10B、miR-199a-5p与HGF等配对在两个队列中均保持强负相关。
四、讨论总结与结论翻译
讨论部分总结： 本研究通过整合miR靶标预测与蛋白表达数据的双重证据分析框架，识别出多个具有诊断和治疗意义的生物标志物及miR-蛋白调控关系。研究发现与既往文献高度一致，验证了分析方法的可靠性。研究提出了两个新的机制假说：miR-144-3p/SFRP1促纤维化轴——miR-144-3p表达降低导致SFRP1水平升高，通过Wnt/β-catenin信号通路失调促进肺泡巨噬细胞向Th2炎症表型极化，增强嗜酸性粒细胞肺部募集，释放促纤维化细胞因子，加重肺纤维化；miR-146a-5p/S100A12中性粒细胞胞外陷阱（NET）形成通路——miR-146a-5p下调解除对NF-κB信号的负反馈抑制，增加S100A12释放，促进NET过度形成，参与重症COVID-19血栓并发症。研究存在若干局限性：两个队列在年龄、种族和地区上存在差异；约31%的UAMS参与者采用替代严重程度分类标准；血浆研究无法提供细胞和组织特异性信息；样本采集时间存在异质性；每组样本量有限；相关性分析只能产生假设，需功能验证确立因果关系。
结论翻译： 在本研究中，研究人员对同一批SARS-CoV-2感染个体的循环miRNA和蛋白表达进行了首次整合分析，并在独立验证队列中加以重复，以识别与COVID-19严重程度相关的生物标志物并阐明调控机制。所识别的大多数miRNA和蛋白生物标志物与既往文献一致，为整合分析方法提供了强有力的表面效度，而新的miR-蛋白调控配对（包括miR-144-3p/SFRP1促纤维化轴和miR-146a-5p/S100A12 NET形成通路）提供了单一组学研究无法推导的机制性假说。血浆中观察到的miRNA-蛋白负相关性占主导地位支持了miRNA介导调控的生物学合理性，并证明整合多组学分析可以超越生物标志物编目，产生可检验的机制性见解。这些发现为理解COVID-19发病机制和严重程度提供了分子框架，可为SARS-CoV-2融入季节性传染病格局背景下的诊断和治疗策略开发提供参考。未来追踪这些miRNA-蛋白配对在感染过程中的纵向变化将有助于深入了解疾病进展动态，并进一步完善本研究所识别的候选靶标。
