茶树花组织间转录程序及候选miRNA–mRNA关系的整合RNA-seq与小RNA-seq解析

《Frontiers in Plant Science》：Integrated RNA-seq and small RNA-seq profiling reveals tissue-associated transcriptional programs and candidate miRNA–mRNA relationships across tea floral tissues

　　

摘要专业翻译 引言： 茶树花由解剖学和功能上特化的组织构成，然而区分这些组织的转录及转录后调控程序仍未得到充分表征。 方法： 本研究将‘福鼎大白茶’（Camellia sinensis cv. ‘Fudingdabaicha’）白苞期花芽解剖为七种组织：子房（ovary）、外轮绿色花瓣（outer green petal）、内轮白色花瓣（inner white petal）、花丝（filament）、萼片（sepal）、花药（anther）和花柱（style）。研究人员从相同的21个生物学样本中制备了RNA-seq和小RNA-seq文库，从而能够直接比较和整合mRNA与miRNA的表达谱。 结果： 在21对组织比较中，共鉴定出33,333个非冗余差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），揭示各组织间转录组差异程度显著。外轮绿色花瓣与内轮白色花瓣的转录组谱最为相似，区分二者的基因主要富集于质体相关及光合作用过程。相比之下，花药与花柱的转录组差异最大，涉及代谢、结构和信号传导功能。加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）鉴定出24个模块，其中三个代表性模块的特征基因分别与花药、萼片和花柱性状呈正相关。这些模块分别富集于花粉萌发与极性生长、细胞壁重塑与器官生长、以及RNA代谢与染色质相关的发育调控过程。对六个代表性基因的RT-qPCR分析显示，其组织表达模式与RNA-seq数据总体一致。小RNA分析鉴定出215个miRNA，包括54个已知植物miRNA家族同源物和161个推定新miRNA（putative novel miRNAs）；其中175个miRNA在不同组织间差异表达。将psRNATarget预测结果与三个代表性模块的候选枢纽基因（candidate hub genes）相交集，获得45对候选miRNA–mRNA关系，涉及39个miRNA和28个候选枢纽基因。六个代表性预测配对在匹配样本中显示出显著的负相关。 讨论： 这些发现表征了茶树花组织中依赖于组织的mRNA和miRNA表达程序，并优先筛选出用于花组织分化和生殖发育功能研究的候选基因及miRNA–mRNA配对。

论文解读

一、研究背景与意义

茶树（Camellia sinensis）是重要的多年生常绿木本经济作物，其幼嫩芽叶被采收用于茶叶生产。除营养生长外，茶树还经历漫长的生殖周期，花芽分化和花器官发育持续数月，营养芽与不同发育阶段的花芽可在同一植株上共存，导致营养生长与生殖生长之间复杂的协调关系。尽管商业茶叶生产主要依赖持续的营养枝梢生长，但开花和结果对茶树的有性生殖、遗传多样性维持及杂交育种至关重要。花和果实作为生殖库，还会改变碳、氮及矿质养分在生殖器官与营养器官之间的分配。此外，茶花富含黄酮类、多酚类、茶皂素、多糖及香气相关化合物等生物活性成分，是具有潜在开发价值的次级资源。

花朵由形态、细胞组成和生理功能各异的器官和组织构成。萼片构成最外层花轮并保护内部发育中的器官，花瓣参与花冠形成和传粉者吸引；花丝支撑花药并促进养分运输，花药负责花粉的形成、成熟和储存；花柱将柱头与子房连接，内含花粉管向胚珠生长的传导组织，子房包裹胚珠并在受精后支持种子和果实发育。尽管这些组织起源于同一朵花，但各自必须建立独特的细胞增殖、运输、信号传导、细胞骨架组织、细胞壁修饰和代谢程序以执行特化功能。以往茶树花分子研究主要针对混合花器官、发育时间序列或异常生殖表型，对正常茶树花芽各解剖组织进行匹配的mRNA和小RNA系统整合分析尚属空白。对同一发育阶段采集的组织进行解剖和独立分析，能够更直接地解析花组织特化和生殖表达程序，因此开展本研究具有重要的科学意义。

二、研究内容概述

研究人员以‘福鼎大白茶’为材料，在河南省信阳市祥云茶基地采集白苞期花芽，将花芽解剖为子房（OV）、外轮绿色花瓣（OG）、内轮白色花瓣（IW）、花丝（FI）、萼片（SE）、花药（AN）和花柱（ST）七种组织。120个花芽随机分为三组，每组分别解剖、合并同类型组织作为一个混合生物学重复，共获得21个样本（7组织×3重复）。从每个样本的同一份总RNA中分别制备RNA-seq和小RNA-seq文库，实现mRNA与miRNA表达谱的一一对应。RNA-seq数据比对至‘舒茶早’v2参考基因组，通过DESeq2进行21对组织间差异表达分析；利用WGCNA构建共表达网络并识别与组织性状相关的模块和候选枢纽基因；小RNA数据经miRDP2预测miRNA，结合psRNATarget靶标预测与共表达模块整合分析，筛选候选miRNA–mRNA关系。

三、主要技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：RNA-seq转录组测序和小RNA-seq测序（基于Illumina NovaSeq 6000平台）；差异表达分析（DESeq2，|log?FC|≥1且校正P<0.05）；加权基因共表达网络分析（WGCNA，软阈值幂为7）；基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析（clusterProfiler）；miRNA鉴定（miRDP2，结合Rfam过滤和miRBase同源比对）；miRNA靶标预测（psRNATarget，Schema V2，最大期望值5）；RT-qPCR验证；Spearman秩相关分析。样本来源于中国河南省信阳市祥云茶基地12株树龄相近、田间管理一致的‘福鼎大白茶’植株。

四、主要研究结果

RNA-seq数据质量与样本关系。 21个RNA-seq文库经质控后获得302.83 Gb干净数据，平均每个文库约4812万对干净读段。比对至‘舒茶早’v2参考基因组的总体比对率为87.34%–89.29%。主成分分析显示同组织生物学重复紧密聚集，七种组织明显分离；同组织重复间Pearson相关系数均大于0.92，表明数据重复性好、适合后续分析。

茶花组织间的转录组差异。 21对组织比较共鉴定出33,333个非冗余DEGs。外轮绿色花瓣与内轮白色花瓣的DEGs最少（3,266个），二者富集的差异基因主要涉及氧化还原过程、rRNA加工、磷酸戊糖途径、光系统II组装、光系统I光合电子传递、叶绿体类囊体膜和叶绿体被膜等质体相关及光合过程。花药与花柱的DEGs最多（21,574个），其中11,898个在花药中高表达、9,676个在花柱中高表达，富集于氧化还原过程、脂肪酸生物合成、脂质代谢、蛋白磷酸化、黄酮生物合成、分生组织生长调控、植物型细胞壁生物发生、胞间连丝及DNA结合转录因子活性等，反映雌雄性生殖组织在代谢、结构和信号传导方面的广泛分化。欧氏距离分析结果与DEGs数量模式一致。RT-qPCR验证的六个代表性基因的组织表达模式与RNA-seq数据总体一致。

共表达网络构建与模块–组织性状关系。 基于33,333个非冗余DEGs构建加权基因共表达网络，软阈值幂为7，经动态树切割和模块合并共鉴定出24个共表达模块。模块–性状相关分析发现七个模块的特征基因与对应组织性状呈正相关。其中，白色模块与子房性状正相关（r=0.92），富集于叶绿体相关结构、光系统组装和磷酸戊糖途径；bisque4模块与内轮白色花瓣正相关（r=0.82），富集于胞外区域、脂肪酸生物合成和过氧化物酶活性；青色模块与外轮绿色花瓣正相关（r=0.72），富集于单加氧酶活性、氧化还原过程和金属离子结合；洋红色模块与花丝性状正相关（r=0.99），富集于脂质代谢、类胡萝卜素生物合成和胞内运输；红色模块与萼片性状正相关（r=0.98），富集于植物型细胞壁、细胞壁组织、多糖生物合成和碳水化合物代谢；青绿色模块与花药性状正相关（r=0.99），富集于花粉管尖端、花粉管生长、肌动蛋白结合、钙离子结合和囊泡介导运输；黄色模块与花柱性状正相关（r=0.83），富集于RNA甲基化、翻译、DNA复制、核小体组装和染色质调控。

三个代表性模块的候选枢纽基因鉴定与共表达网络分析。 从花药相关的青绿色模块、萼片相关的红色模块和花柱相关的黄色模块中共筛选出111个候选枢纽基因，分别为38、35和38个。青绿色模块候选枢纽基因富集于花粉萌发、花粉管生长、肌动蛋白细胞骨架组织、Ca2?相关信号传导、囊泡介导运输和细胞壁修饰，与花粉成熟、萌发及后续极性生长所需过程一致。红色模块候选枢纽基因富集于细胞壁组织、果胶修饰、多糖生物合成、碳水化合物代谢、胞外结构和脂质相关过程，与萼片细胞壁形成和组织扩张一致。黄色模块候选枢纽基因富集于RNA加工、翻译、DNA复制、核小体组装、染色质组织、DNA修复和花发育相关转录调控，表明花柱中核酸代谢和发育调控活性突出。

七种花组织中miRNA的鉴定与表达谱。 小RNA测序共获得333,195,098条干净读段，比对率均超过85.63%，平均88.85%。共鉴定出215个非冗余miRNA，其中54个为已知植物miRNA家族同源物（隶属14个家族），161个为推定新miRNA。成熟miRNA长度范围为20–23 nt，以22 nt类为主（118个），其次为21 nt（58个）、20 nt（37个）和23 nt（2个）。84个miRNA的5′末端核苷酸为U，占39.1%。UpSet分析显示27个miRNA位点仅在花药文库中检出，23个位点在全部七种组织中检出。21对组织比较中共鉴定出175个非冗余差异表达miRNA，子房–花药比较差异miRNA最多（107个），外轮绿色花瓣–内轮白色花瓣比较最少（21个）。在所有涉及花药的六组比较中，花药中高表达的miRNA数量均多于对应比较组织。

miRNA与候选枢纽基因的整合分析。 psRNATarget共预测出25,835对非冗余miRNA–mRNA关系，涉及215个miRNA和12,196个候选靶基因。与三个代表性模块的候选枢纽基因相交集后获得45对预测miRNA–候选枢纽基因关系，涉及39个miRNA和28个候选枢纽基因。花药相关青绿色网络包含16个miRNA与12个候选枢纽基因之间的19对预测关系，靶基因主要涉及花粉管生长、肌动蛋白细胞骨架组织、Ca2?相关信号传导、囊泡介导运输和细胞壁修饰。萼片相关红色网络包含14个miRNA与9个候选枢纽基因之间的16对预测关系，靶基因与细胞壁和果胶重塑、多糖代谢及生长素运输相关。花柱相关黄色网络包含10个miRNA与7个候选枢纽基因之间的10对预测关系，靶基因与RNA加工、翻译、染色质调控和花发育相关转录调控相关。六个代表性预测配对在21个匹配样本中表现出显著负相关（Spearman's ρ范围?0.953至?0.847，校正P<0.05），组织均值水平上miRNA与对应预测靶基因呈现相反的相对表达模式。

五、讨论与结论

讨论部分指出，七种组织在主成分分析中的分离和大量DEGs表明茶花芽在白苞期存在显著的转录特化，这一模式与保护性外层器官及雌雄性生殖组织的不同功能一致。外轮绿色花瓣与内轮白色花瓣共享花瓣同一性和相关解剖特征，区分二者的基因主要涉及质体相关及光合过程，与菊花绿色和非绿色花瓣的研究一致，表明质体相关过程是两种花瓣组织分子分化的主要来源。花药与花柱的差异最大，与二者不同的细胞组成和生殖功能一致。花药相关模块富集于花粉萌发、花粉管生长、肌动蛋白细胞骨架组织、钙离子结合、囊泡介导运输和细胞壁修饰，与花粉管极性生长所需的细胞骨架动态、胞内运输、膜运输和细胞壁重塑协调过程一致。萼片相关模块反映细胞壁重塑和生长调控，与萼片包裹内部发育器官时的扩张需求一致。花柱相关模块富集于RNA加工、RNA甲基化、翻译、DNA复制、核小体组装、染色质组织和发育转录调控，可能反映花柱成熟和功能性传导组织建立所需的生物合成和调控活性。miRNA分析方面，22 nt为主要长度类别，5′ U偏好与AGO1相关植物miRNA的序列偏好一致。子房与花药差异表达miRNA最多，外轮绿色花瓣与内轮白色花瓣最少，与mRNA数据的相对转录组差异平行。将psRNATarget预测与候选枢纽基因交集后，候选miRNA–mRNA关系从初始预测集缩减至45对，使预测靶标定位于与花药、萼片和花柱功能相关的共表达程序中。

研究结论为：本研究表征了茶树七种花组织中配对的mRNA和miRNA表达谱，鉴定出与花药、萼片和花柱功能相关的组织特异性共表达程序。小RNA谱、靶标预测与mRNA共表达网络的整合进一步优先筛选出用于茶树花组织分化和生殖发育功能分析的候选基因及miRNA–mRNA配对。