《Frontiers in Neurology》：Circulating NETosis biomarkers predict severity, 12-month functional outcome, and survival after spontaneous intracerebral hemorrhage
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背景：自发性脑出血（spontaneous intracerebral hemorrhage，ICH）具有较高的早期死亡率和长期致残率；然而，目前缺乏能够同时反映出血严重程度和预后的循环生物标志物。中性粒细胞胞外陷阱形成（neutrophil extracel
背景：自发性脑出血（spontaneous intracerebral hemorrhage，ICH）具有较高的早期死亡率和长期致残率；然而，目前缺乏能够同时反映出血严重程度和预后的循环生物标志物。中性粒细胞胞外陷阱形成（neutrophil extracellular trap formation，NETosis）可在血浆中通过瓜氨酸化组蛋白H3（citrullinated histone H3，H3Cit）、游离细胞DNA（cell-free DNA，cfDNA）和核小体进行定量，已被认为参与ICH后的继发性脑损伤。方法：研究纳入了315例发病24小时内的首发自发性ICH成人患者和160例社区对照者。记录了血浆H3Cit、cfDNA和核小体水平、入院血肿体积、美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）评分和格拉斯哥昏迷量表（GCS）评分；并在12个月时评估改良Rankin量表（modified Rankin Scale，mRS）评分。NETosis生物标志物以log2转换的连续变量纳入线性回归、logistic回归和Cox回归，并逐步校正采血时间、人口学特征、血管危险因素、手术治疗、NIHSS评分和血肿体积。使用受试者工作特征曲线下面积（area under the receiver operating characteristic curve，AUC）/一致性指数（concordance index，C-index）、连续净重分类改善指数（net reclassification improvement，NRI）和综合判别改善指数（integrated discrimination improvement，IDI）评估在临床基线模型之上的增量预测价值。结果：三项生物标志物在ICH患者中均高于对照者（均p < 0.001），且12个月死亡者较存活者高出数倍，尽管绝对中性粒细胞计数无差异。校正后，H3Cit与血肿体积、NIHSS和GCS独立相关；cfDNA和核小体与血肿体积独立相关。在全面校正人口学特征、血管危险因素、手术治疗、NIHSS和血肿体积后，H3Cit每增加一倍（OR：1.577，95% CI：1.368–1.838）、cfDNA每增加一倍（OR：1.687，95% CI：1.259–2.291）和核小体每增加一倍（OR：1.622，95% CI：1.297–2.057）均独立预测12个月mRS≥3（均p < 0.001）；每增加一倍，H3Cit（HR：1.358，95% CI：1.207–1.528）、cfDNA（HR：1.619，95% CI：1.287–2.038）和核小体（HR：1.568，95% CI：1.310–1.877）均独立预测12个月死亡。加入H3Cit后，预测mRS≥3的AUC从0.814提升至0.869（ΔAUC：0.055，p < 0.001），预测死亡的C-index从0.765提升至0.818（ΔC：0.052，p < 0.001）；cfDNA和核小体的判别能力增益不显著，但NRI和IDI有所改善。结论：ICH后24小时内测定的血浆H3Cit、cfDNA和核小体可反映出血严重程度，并在既定临床评分之外独立预测12个月mRS≥3和死亡，其中H3Cit显示出最一致的增量预测价值。
**论文解读：循环NETosis生物标志物对自发性脑出血严重程度、12个月功能结局及生存率的预测价值**
**一、研究背景与问题提出**
自发性脑出血（spontaneous intracerebral hemorrhage，ICH）是最具致命性的急性卒中亚型，约半数患者在一年内死亡，且幸存者中相当比例遗留严重残疾。全球流行病学数据显示，ICH持续位居卒中相关死亡和残疾的主要原因之列，且随着人口老龄化，其绝对负担不断上升。ICH的不良预后不仅由原发性血肿本身驱动，还涉及血肿扩大、血肿周围水肿以及由氧化应激、铁毒性、血脑屏障破坏和强烈神经炎症构成的继发性损伤级联反应。其中，外周中性粒细胞的早期浸润在ICH后脑水肿、白质损伤和长期残疾中发挥重要作用。尽管近年来手术和支持治疗策略有所进展，但ICH仍缺乏靶向的疾病修饰疗法，预后判断仍主要依赖初始血肿体积、美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）评分和格拉斯哥昏迷量表（GCS）评分。
既往已探索多种循环生物标志物用于细化ICH预后评估，包括轴突损伤标志物神经丝轻链（NfL）、急性期蛋白（SERPINA3、C反应蛋白）、炎症细胞因子（白细胞介素-6）、补体因子（C1q）、胶质蛋白（S100B）及应激性高血糖标志物等。然而，这些标志物各自反映的是损伤反应的不同侧面：NfL主要反映晚期轴突损伤而非急性出血负荷；白细胞介素-6等炎症细胞因子反映的是下游炎症反应的整体强度而非产生该反应的细胞过程；SERPINA3等急性期反应物捕获的是系统性损伤而未明确其细胞来源。此外，来源于常规血常规检测的系统性免疫激活指标——中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）、血小板与白细胞比值（PWR）和系统性炎症反应指数（SIRI）——在ICH后具有确实的预后信息价值，且成本低廉、易于获取。但这些指标量化的是循环白细胞的数量和相对组成，而非这些细胞已执行的特定效应程序，其所携带的信息并不总是可互换的。因此，学界持续关注能够更直接地反映ICH后早期、机制相关免疫事件的生物标志物。
NETosis是中性粒细胞的一种受调控的细胞死亡形式，在此过程中，去浓缩的染色质、瓜氨酸化组蛋白和颗粒蛋白被挤出至细胞外空间。中性粒细胞胞外陷阱（NETs）可放大血栓炎症，并与补体和凝血系统相互作用，将固有免疫与血管损伤联系起来。在ICH中，中性粒细胞在血肿内及周围聚集，释放的NETs已在人脑尸检组织中被可视化，并在动物模型中得以复制。机制上，NETs通过ERK介导的MMP9和AQP4调控促进血肿周围水肿，损伤脑膜淋巴引流从而加重继发性脑积水，并驱动小胶质细胞活化和慢性神经炎症。临床前研究显示，抑制NET形成可减轻ICH和缺血性卒中模型中的脑损伤，支持NETs既可作为治疗靶点，也可作为生物标志物底物。三种血浆分析物——H3Cit（由PAD4酶促生成，三者中特异性最高）、cfDNA（敏感性较高但也反映其他形式的细胞死亡）和循环核小体（捕获NETs及其他背景下的染色质释放）——已成为NETosis的实用读取指标。这些NETosis生物标志物可预测癌症、脓毒症和心血管疾病中的死亡率，但其与ICH后出血负荷、功能残疾和生存率的联合关联尚未被系统表征。因此，研究者开展了一项队列研究，旨在检验ICH后24小时内测定的循环H3Cit、cfDNA和核小体是否与入院严重程度、12个月功能结局和12个月生存率相关，并量化其在既定临床基线模型之上的增量预测价值。
**二、研究设计与主要技术方法**
该研究为一项单中心观察性队列研究，于2022年1月至2025年1月期间在河南医科大学第一附属医院神经外科开展，共纳入315例首发自发性ICH成人患者（发病24小时内采血）和160例同期招募的社区健康对照者。主要技术方法包括：（1）NETosis生物标志物检测：采用已发表的检测方案，血浆H3Cit由自制夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）定量（捕获抗体来自Cell Death Detection ELISA Kit，检测抗体为兔抗瓜氨酸化组蛋白H3抗体ab5103）；cfDNA采用Quant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒定量；核小体采用Cell Death Detection ELISA
PLUS试剂盒测定并标准化为年轻健康男性对照混合血浆的倍数中位数（MoM）。所有检测均设双复孔，由对临床数据设盲的操作者执行，并通过板内和板间质控样本监测检测性能。（2）临床评估：记录入院时人口学特征、血管危险因素、常规实验室数据，以及预先设定的严重程度变量——ABC/2法估算的血肿体积、NIHSS评分和GCS评分（采血时记录）。所有ICH患者在出院后1、3、6、12个月随访生存状态，12个月时于门诊采用mRS评估功能结局，并二分为mRS<3（预后良好）与mRS≥3（预后不良）。（3）统计分析：NETosis生物标志物以log2转换的连续变量纳入模型；入院血肿体积、NIHSS和GCS在多元线性回归中以平方根转换变量建模，评估各生物标志物与严重程度指标的关联；采用多因素logistic回归评估各生物标志物与12个月mRS≥3的关联；采用多因素Cox比例风险回归评估各生物标志物（连续变量及Q4与Q1–3分类变量）与12个月全因死亡的关联。增量预测价值评估基于包含采血时间、年龄、性别、当前吸烟、高血压、既往脑血管病、糖尿病、手术治疗、NIHSS和血肿体积的预设临床基线模型，分别使用AUC（DeLong检验）和Harrell's C-index（2000次bootstrap重抽样）评估判别改善，并计算连续NRI和IDI。因对照组与ICH患者在年龄和性别上存在差异，另构建了1:1倾向性评分匹配亚组进行敏感性分析。
**三、主要研究结果**
**3.1 基线特征与NETosis生物标志物分布**
ICH患者（n=315）较对照者（n=160）年龄更大、男性占比更高。全部三项血浆NETosis生物标志物在ICH患者中均显著高于对照者：H3Cit为37.4（10.8–149.9）对3.9（0.0–8.2）ng/mL，cfDNA为568.6（336.0–907.0）对203.1（140.5–293.9）ng/mL，核小体为3.688（1.863–7.499）对0.958（0.626–1.326）MoM（均p<0.001）。在ICH患者中，12个月死亡者（n=72）与存活者（n=243）的绝对中性粒细胞计数无差异（9.83±2.88对9.29±2.95×10
9/L，p=0.273），但死亡者的三项NETosis生物标志物均较存活者高出数倍。倾向性评分匹配（113对，年龄和性别SMD均<0.10）后，所有三项标志物在ICH患者中仍显著高于对照者。按采血时间分层，仅H3Cit在12–24小时采血层中略高（p=0.034），cfDNA和核小体在各时间层间无差异。
**3.2 NETosis生物标志物与急性出血严重程度**
多因素线性回归显示，在校正采血时间、年龄、性别、当前吸烟、高血压、既往脑血管病和糖尿病后，H3Cit每增加一倍与√血肿体积增加0.291单位（p<0.001）、√NIHSS增加0.206单位（p<0.001）和√GCS降低0.060单位（p<0.001）独立相关。log2(cfDNA)与√血肿体积独立相关（β=0.279，p=0.041），但与√NIHSS和√GCS的关联在校正后减弱。log2(核小体)与√血肿体积（β=0.214，p=0.033）和√NIHSS（β=0.104，p=0.049）独立相关。在三个严重程度结局和三种生物标志物中，H3Cit与急性出血严重程度的关联最为一致且统计学上最为稳健。
**3.3 NETosis生物标志物与12个月功能结局**
12个月时，123例（39.0%）ICH患者出现不良功能结局（mRS≥3）。多因素logistic回归显示，在每log2单位的分析中，三项生物标志物在所有校正模型中均与12个月mRS≥3显著相关。在全面校正（Model 2+NIHSS+血肿体积）后，H3Cit（OR：1.577，95% CI：1.368–1.838）、cfDNA（OR：1.687，95% CI：1.259–2.291）和核小体（OR：1.622，95% CI：1.297–2.057）仍保持独立关联（均p<0.001）。增量预测价值分析显示，在临床基线模型（AUC：0.814）上加入H3Cit可将AUC显著提升至0.869（ΔAUC：0.055，p<0.001），连续NRI为0.803（p<0.001），IDI为0.108（p<0.001）。加入cfDNA或核小体的AUC增益较小（分别为0.015和0.021），未达统计学显著性，但两者的连续NRI和IDI均有显著改善。
**3.4 NETosis生物标志物与12个月生存率**
Kaplan–Meier分析显示，以第75百分位数（Q4与Q1–3）分层时，三项生物标志物Q4组的12个月累积全因死亡率均显著更高（log-rank p<0.001）。多因素Cox回归在连续尺度上证实了这些关联：全面校正后，每log2单位的HR分别为H3Cit 1.358（95% CI：1.207–1.528）、cfDNA 1.619（95% CI：1.287–2.038）和核小体1.568（95% CI：1.310–1.877）（均p<0.001）。分类分析中，Q4对Q1–3的校正HR为H3Cit 2.214（95% CI：1.319–3.715，p=0.003）、cfDNA 2.580（95% CI：1.589–4.190，p<0.001）和核小体2.588（95% CI：1.594–4.201，p<0.001）。增量预测价值方面，在基线Cox模型（C-index：0.765）上加入H3Cit将C-index显著提升至0.818（ΔC-index：0.052，p<0.001），连续NRI为0.760（p<0.001），IDI为0.074（p=0.002）。核小体的C-index增益未达统计学显著性（ΔC-index：0.019，p=0.054），但连续NRI（0.525，p<0.001）和IDI（0.073，p<0.001）显著改善。cfDNA的C-index变化亦未达显著性（ΔC-index：0.013，p=0.170），但连续NRI（0.413，p=0.028）和IDI（0.048，p=0.017）显著改善。在所有指标中，H3Cit再次显示出最大的增量获益。
**四、讨论与结论总结**
讨论部分指出，该研究在315例首发自发性ICH成人患者中系统评估了发病24小时内测定的三种循环NETosis生物标志物（H3Cit、cfDNA和核小体）在多维预后场景中的表现。三项标志物在ICH患者中均显著升高，并在校正模型中与不良结局保持关联，但性能并不一致。H3Cit表现最为一致：校正后与√血肿体积、√NIHSS和√GCS独立相关；在全面校正模型中仍是12个月mRS≥3和12个月死亡率的独立预测因子；在增量分析中，ΔAUC/ΔC-index、连续NRI和IDI均有统计学显著改善。cfDNA和核小体在校正模型中同样独立预测12个月mRS≥3和死亡，且在重分类指标上显示残余预后价值，但判别能力增益有限。从临床角度看，这些发现支持一种可在入院时获得的、基于生物学信息的单一血液检测组合，其捕获的信息未被NIHSS、GCS或血肿体积完全编码，与NfL（反映神经轴突损伤）和SERPINA3（反映星形胶质细胞驱动的持续神经炎症）在概念和时间上互补，增加了独立的中性粒细胞来源的固有免疫轴信息。H3Cit的最强表现与其对PAD4驱动NETosis的生物学特异性一致——cfDNA和核小体可因凋亡、坏死及多种系统应激源升高，而H3Cit主要限于中性粒细胞染色质去浓缩，因此是所关注免疫机制相对纯净的读取指标。值得注意的是，ICH患者中绝对中性粒细胞计数不能区分12个月死亡者与存活者，而三种NETosis标志物在死亡者中高出数倍，这提示与不良结局相关的是NETosis程序的定性参与——而非中性粒细胞增多本身。该研究亦与血常规来源免疫指标（如NLR、PWR和SIRI）的既有文献进行了对比，指出这些指标是非特异性系统炎症激活指标，而H3Cit与一个明确定义的分子通路——PAD4依赖性染色质去浓缩——相关联，且该通路本身可被药理学干预（如PAD4抑制剂GSK484），具有转化意义。讨论还从机制文献角度支持了这些关联的生物学合理性：NETs通过ERK介导的MMP9和AQP4上调促进血肿周围水肿，损伤脑膜淋巴引流加重继发性脑积水，并与小胶质细胞双向串扰维持慢性神经炎症。研究局限包括：单中心设计需外部验证；未进行连续采血，无法描述NETosis的时间轨迹；三种指标均非ICH特异性；H3Cit检测为实验室自制方法，绝对浓度在不同实验室间不可直接转移；临床效用的最终证明需要决策影响研究。
**研究结论**：在首发自发性ICH成人患者中，发病24小时内测定的血浆H3Cit、cfDNA和核小体可反映入院血肿体积和严重程度，并在既定临床评分之外独立预测12个月功能结局和生存率。H3Cit显示出最一致的增量预后价值，支持其进一步开发为ICH的血液预后生物标志物，并作为NET靶向神经保护试验的候选富集标志物。
