基于空腔度调控的普鲁士蓝-介孔二氧化硅纳米平台用于化学-光热联合癌症治疗及其初步微流控灌注评价

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Hollow-degree-tuned Prussian blue–mesoporous silica nanoplatforms for chemo-photothermal cancer therapy with preliminary microfluidic perfusion evaluation

　　

背景： 在多功能纳米药物的结构设计中，平衡光热性能与药物递送能力仍是一项关键挑战。空腔化可增加内部空间以容纳药物，但同时可能减少近红外（NIR）吸收性普鲁士蓝（PB）的含量，从而在药物递送能力与光热性能之间形成固有的权衡关系。 方法： 研究人员通过可控盐酸（HCl）刻蚀调控中空介孔普鲁士蓝（HMPB）纳米立方体的空腔状态，随后采用常规介孔二氧化硅（mSiO2）包覆，制备了低、中、高空腔度三种制剂。对所得制剂进行了理化性质、光热性能、阿霉素（DOX）载药与释放、细胞响应、细胞内荧光、化学-光热相互作用以及初步微流控灌注性能的评价。 结果： 空腔度的增加使DOX载药量从525 μg·mg?1提升至867 μg·mg?1，并促进了药物释放，但光热性能随之逐步下降。1-、2-和3-HMPB@mSiO2的实测光热转换效率分别为23.37%、18.62%和14.41%。电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）显示，随着空腔度增加，铁（Fe）含量逐渐降低；而PB等效质量匹配测量所得的光热转换效率相近（16.80%、15.80%和14.41%），表明PB丰度是导致光热差异的主要因素。与pH 7.4/37 °C条件相比，温和酸性和温和热疗均增强了DOX释放。经处理匹配校正纳米颗粒相关光学干扰后，空白载体在24 h内对HeLa细胞表现出有限的急性载体相关细胞毒性，定量荧光成像证实了有效的细胞内DOX递送。在相同总制剂浓度下，中等空腔度的2-HMPB@mSiO2-DOX制剂产生了最强的联合治疗响应。多剂量联合指数（CI）、Bliss独立性和Loewe可加性分析进一步支持化学-光热相互作用随治疗效果增强而日益协同。在生理介质中的初步注射泵驱动微流控灌注保留了颗粒分散、药物渗漏和近红外加热方面的主要结构依赖性趋势。 结论： 这些结果表明，空腔度工程为平衡PB基纳米平台中光热与药物递送两种相互竞争的功能提供了一种实用策略。

论文解读

一、研究背景与问题

当前临床癌症治疗手段包括手术、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗。尽管取得了重大进展，单一疗法仍受限于不完全响应、治疗相关毒性、复发以及内在性或获得性耐药等问题。耐药性可源于药物递送效率低下、肿瘤异质性、基因表达改变以及免疫抑制性肿瘤微环境。为应对这些局限，研究者开发了多种策略，包括纳米载体介导的药物递送、个体化治疗、肿瘤微环境调控和多模式治疗。纳米材料平台因其可将化疗与光热、光动力、免疫或放疗功能整合于一体而备受关注。微流控和器官芯片系统进一步提供了可控流动和微生理环境，可在传统静态培养之外评价纳米载体的转运和治疗响应。

普鲁士蓝（PB）是一种成熟的近红外（NIR）响应材料，可用于光热治疗、成像和药物递送。其光学响应、胶体行为和生物学功能可通过金属离子掺杂、聚合物修饰和结构工程进行调控。中空PB纳米笼已被用作联合化疗和光热治疗的药物储库。与此同时，介孔二氧化硅与PB的整合可提供多孔载药界面、表面稳定化和额外功能化选项。

然而，大多数PB基治疗性纳米平台围绕固定的颗粒结构、表面修饰或载荷进行优化。空腔化引入了固有的设计权衡：去除PB会减少NIR吸收材料的量，而新产生的内部空间可增加药物容纳能力。因此，随着空腔化进程推进，光热输出和药物递送能力可能朝相反方向变化。研究人员前期开发的HMPB@mSiO₂平台证明了将中空介孔PB核心与mSiO₂壳层结合用于药物递送和光热治疗的可行性，但空腔状态依赖的结构-性能关系尚未被系统比较。

研究人员因此假设：较低的空腔度有利于PB依赖的光热性能，而较高的空腔度有利于药物负载和释放。如果这两种相反趋势共存，中等空腔结构应比任一结构极端提供更有利的化学-光热联合治疗功能平衡。

二、研究内容与结论

为验证这一假设，研究人员采用HCl介导的刻蚀生成三种基准HMPB空腔状态，每种状态均经相同的mSiO₂包覆流程处理。研究人员比较了形态、理化性质、光热转换、DOX负载和释放、细胞响应、细胞内荧光以及化学-光热相互作用，并纳入了更广泛的HCl刻蚀筛选和独立重复合成以界定可获得的形态范围并评估结构可重复性。随后利用初步微流控灌注考察主要材料趋势在流动条件下是否得以保留。

研究得出以下核心结论：受控HCl刻蚀生成了三种不同的HMPB空腔状态，揭示了PB依赖的光热转换与空腔状态相关的药物负载/释放之间的反比关系。低空腔度的1-HMPB@mSiO₂表现出最强的光热响应，而高空腔度的3-HMPB@mSiO₂提供了最大的DOX负载和释放。在相同总制剂浓度下，中等空腔度的2-HMPB@mSiO₂-DOX产生了最有利的联合治疗响应。多剂量CI、Bliss和Loewe分析支持在中高效应水平下日益协同的相互作用，而在最低效应水平下表现为近似可加/轻微拮抗。初步微流控灌注在流动条件下保留了分散性、药物渗漏和NIR加热方面的主要结构依赖性趋势。

这项研究的意义在于证明了空腔度工程为平衡PB基纳米平台中相互竞争的光热和药物递送功能提供了一种实用策略，为多功能纳米药物的结构优化设计提供了系统性的方法论参考。

三、关键技术方法

研究人员主要采用了以下几项关键技术方法：其一，HCl/PVP介导的空腔度调控技术，通过不同浓度盐酸（0.5、0.75、1.0 M）在140 °C下对介孔普鲁士蓝（MPB）纳米立方体进行可控刻蚀，生成低、中、高空腔度的HMPB；其二，介孔二氧化硅包覆技术，利用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）为模板、正硅酸四乙酯（TEOS）为硅源，在48 °C下反应48 h后经乙醇/HCl回流萃取去除模板，获得n-HMPB@mSiO₂复合纳米平台；其三，多维度表征体系，包括透射电子显微镜（TEM）结合ImageJ定量分析结构参数、氮气吸附-脱附等温线测定比表面积与孔径分布、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和X射线衍射（XRD）确认化学组成、动态光散射（DLS）和Zeta电位评价胶体性质；其四，光热性能评价体系，包括浓度和功率依赖性升温测试、光热循环稳定性测试及基于Hoffman方法的光热转换效率计算，并辅以ICP-MS测定铁含量和PB等效质量匹配测量以区分PB丰度贡献；其五，体外细胞实验体系，包括MTT法细胞毒性检测（含处理匹配的光学干扰校正）、高内涵成像系统定量分析细胞内DOX荧光强度，以及多剂量联合指数（CI）、Bliss独立性和Loewe可加性三种协同性定量分析框架；其六，初步微流控灌注评价系统，采用注射泵驱动的直通道玻璃底板微流控芯片，在含10%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）中于5、20、50 μL·min^?1流速下评价颗粒回收率、粒径变化、多分散指数（PDI）、24 h药物渗漏和NIR加热性能。

四、研究结果

形态学表征： TEM分析显示，随着HCl浓度从0.5 M增至1.0 M，HMPB内部结构从致密多孔逐步演变为明显空腔并最终形成广泛中空结构，PB壁厚从22.4 ± 2.7 nm降至13.4 ± 2.7 nm，估计空腔体积分数从33.9% ± 4.2%增至53.0% ± 2.4%。更广泛的刻蚀筛选（0.25–1.10 M）界定了形态范围，1.10 M时出现壳层破裂。三批独立重复合成均再现了相同的形态序列，支持HCl介导形态控制的可重复性。mSiO₂包覆后各制剂保留了其特征性内部状态。

理化性质表征： FT-IR光谱确认了Si-O-Si和Si-OH振动峰，XRD显示约2θ = 22.8°的非晶态二氧化硅宽峰。三种包覆样品均呈现IV型氮气吸附-脱附等温线，BET比表面积分别为598、674和879 m²·g^?1，平均孔径为3.2、3.2和4.2 nm。DLS显示包覆后粒径增加约45–48 nm，三种制剂的二氧化硅层贡献大致相当。Zeta电位在刻蚀后逐渐负电性减弱，包覆后均恢复至约?24 mV。

光热性能表征： 在相同复合颗粒浓度下，光热性能始终遵循1-HMPB@mSiO₂ > 2-HMPB@mSiO₂ > 3-HMPB@mSiO₂的顺序。三种制剂在三个ON/OFF循环中保持相似的加热-冷却曲线。实测光热转换效率分别为23.37%、18.62%和14.41%。ICP-MS测得铁含量分别为31.40 ± 0.80、26.60 ± 0.70和21.30 ± 0.60 wt%，对应PB等效质量分数为69.01%、58.46%和46.81%。PB等效质量匹配后转换效率收敛至16.80%、15.80%和14.41%，表明PB丰度是光热差异的主要贡献因素。

药物负载与释放表征： DOX负载量随空腔度增加而提高，DLC分别为525、714和867 μg·mg^?1，EE分别为52.5%、71.4%和86.7%。三批独立合成的CV值仅为4.3%、2.8%和3.0%。释放实验表明，pH 6.0和42.5 °C均促进DOX释放，联合条件释放量最大，释放量顺序为3-HMPB@mSiO₂ > 2-HMPB@mSiO₂ > 1-HMPB@mSiO₂。

体外细胞实验： 经处理匹配校正后，三种空白载体在62.5–1000 μg·mL^?1范围内均维持高HeLa细胞活性，1000 μg·mL^?1时校正活性仍约82%–84%。化疗单独组中3-HMPB@mSiO₂-DOX细胞毒性最强，PTT单独组中1-HMPB@mSiO₂响应最强，联合治疗组中2-HMPB@mSiO₂-DOX产生最低细胞活性约33%，显著低于其他两种制剂（P < 0.01）。高内涵成像确认了有效的细胞内DOX递送，2-HMPB@mSiO₂-DOX与游离DOX的MFI无显著差异。

定量协同性分析： 固定比例系列中CI值从最低效应水平的1.098逐步降至最高效应水平的0.656，表明随效应增强协同性增加。Bliss响应面在宽组合区域内呈正值，最大超额Bliss值达17.0个百分点。Loewe分析中同Fa组合点均低于可加性等效应线，CI值约为0.95、0.82和0.71。

初步微流控灌注评价： 颗粒回收率在5–50 μL·min^?1范围内保持较高但随流速增加适度下降。灌注后Z-average粒径仅适度增加，PDI保持在窄范围内。24 h DOX渗漏保持有限并保留结构依赖性顺序。20 μL·min^?1流速下NIR加热再现了静态光热排序。

五、讨论与结论

讨论部分指出，研究结果验证了空腔度工程可在PB基纳米平台中平衡光热与药物递送功能的假设。PB等效质量匹配实验明确了PB丰度对光热性能的主要贡献，而残余趋势提示结构和界面因素的额外作用。协同性分析表明，在低暴露水平下CI估计对单药剂量-效应拟合的微小偏差更为敏感，而随剂量升高，更强的光热应激可促进药物释放并增加细胞对化疗的敏感性，从而使联合效应日益协同。微流控灌注结果初步证明主要材料趋势在生理流动条件下得以保留。研究局限性包括仅使用HeLa细胞系，未来需纳入更多癌细胞系、正常/非恶性细胞、三维肿瘤模型和体内系统以进一步评估治疗普适性和生物安全性，同时需关注长期生物安全性和生物降解、药代动力学/生物分布和清除以及工艺规模的可重复性和质量控制。结论部分指出，受控HCl刻蚀生成三种不同HMPB空腔状态，揭示了PB依赖光热转换与空腔相关药物负载/释放之间的反比关系；中等空腔度的2-HMPB@mSiO₂-DOX在相同总制剂浓度下产生最有利的联合治疗响应；多剂量CI、Bliss和Loewe分析支持中高效应水平下日益协同的相互作用；初步微流控灌注在流动条件下保留了主要结构依赖性趋势。空腔度工程为平衡PB基纳米平台中相互竞争的光热和药物递送功能提供了一种实用策略。