《Veterinary Parasitology》：Targeting sexual stage-specific flagellar proteins to develop vaccines for feline toxoplasmosis
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●Δcfap221 速殖子和重组 CFAP221 蛋白对猫均是安全的。●两种疫苗接种策略均可将 弓形虫（T. gondii） 卵囊排出量减少 70% 以上。●铝佐剂联合重组 CFAP221 蛋白可完全阻止卵囊排出。引言刚地弓形虫（Toxoplasma gondii） 是一种普
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Δcfap221 速殖子和重组 CFAP221 蛋白对猫均是安全的。
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两种疫苗接种策略均可将 弓形虫（T. gondii） 卵囊排出量减少 70% 以上。
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铝佐剂联合重组 CFAP221 蛋白可完全阻止卵囊排出。
引言
刚地弓形虫（Toxoplasma gondii） 是一种普遍存在的胞内寄生虫，感染全球多达三分之一的人口。尽管在健康个体中感染通常无明显症状，但妊娠期初次感染可导致流产和严重的先天性缺陷，而免疫缺陷患者体内的寄生虫再激活常引发危及生命的并发症（Arranz-Solís 等，2021）。此外，弓形虫病给畜牧业造成重大经济损失，主要表现为诱发绵羊和猪流产（Stelzer 等，2019）。弓形虫 的生活周期包括三个不同的感染阶段：速殖子、缓殖子（组织包囊）和卵囊。其中，卵囊是广泛传播的主要驱动因素；一旦排入环境，卵囊会发生孢子化而具有传染性，且由于其极强的环境抵抗力，可在外界存活数月之久（Dubey, 1998; Frenkel 和 Dubey, 1973）。鉴于猫是弓形虫唯一的终宿主，在摄入组织包囊后可排出数百万枚卵囊，因此开发针对猫体内 弓形虫 有性发育的疫苗，是阻断其传播的一种高效策略（Dubey 和 Frenkel, 1972）。
目前，唯一的商业化疫苗为 Toxovax?，即一种经许可可用于绵羊、预防流产的减毒活 S48 株疫苗（Buxton 和 Innes, 1995）。尽管 S48 株经小鼠连续传代后已丧失形成组织包囊和卵囊的能力，但其遗传背景未明确定义，引发了对毒力回复突变潜在风险的担忧。近几十年来，大量研究工作致力于开发更安全的疫苗，包括减毒活基因缺失突变株、重组亚单位疫苗和 DNA 疫苗（Wang 等，2019）。然而，大多数候选疫苗仅在小鼠模型中评估了其保护效力。尽管卵囊在 弓形虫 传播中发挥着关键作用，但目前关于疫苗如何预防猫体内卵囊排出的研究仍十分有限。
迄今为止，仅鉴定出两种阻断传播的活疫苗候选株：化学诱变的 T-263 株和 HAP2 缺陷突变株（Dubey, 2017; Frenkel 等, 1991; Freyre 等, 1993; Ramakrishnan 等, 2019）。这两种菌株的共同特征是无法完成完整的配子形成或受精过程，因此不会排出卵囊；然而，它们仍具有免疫原性，并能有效保护猫免受野生型寄生虫攻击后排出卵囊（Freyre 等, 1993; Ramakrishnan 等, 2019）。除减毒活候选株外，研究还探讨了亚单位疫苗在猫中的潜在应用。例如，此前的研究已表明，以重组 GRA12 或粗提子粒体蛋白进行免疫，可减少 弓形虫 卵囊的排出量（Garcia 等, 2007; Yang 等, 2025）。然而，由于这些蛋白主要在速殖子阶段表达，并参与宿主细胞侵袭，因此它们并未直接靶向寄生虫的有性发育过程（Behnke 等, 2014）。因此，目前关于源自关键有性期蛋白的候选疫苗用于猫免疫的实验数据十分有限。
转录组学技术的进步，尤其是在单细胞层面，促进了 弓形虫 在猫肠道内进行球虫发育时基因表达模式的高分辨率表征（Alrubaye 等, 2026; Behnke 等, 2014; Ramakrishnan 等, 2019）。这些研究揭示了一组有性期特异性基因，包括 HAP2、PF16（精子相关抗原 6）以及纤毛和鞭毛相关蛋白（CFAP）家族的成员（Alrubaye 等, 2026; Ramakrishnan 等, 2019）。CFAP 作为高度保守的结构性和调控性机器蛋白，锚定于真核生物纤毛和鞭毛的轴丝、基体和微管支架，通过调控雄性配子鞭毛的组装、成熟和运动性，成为配子形成的关键驱动因素。CFAP 蛋白（如 CFAP33、CFAP34 和 CFAP69）的缺乏会导致鞭毛多重形态异常（MMAF），并引起人类和小鼠的男性不育（Dong 等, 2018; Li 等, 2019; Tang 等, 2017; Wu 等, 2023）。尽管已在顶复门寄生虫中鉴定出多个保守的 CFAP 蛋白，但它们在寄生虫有性发育中的具体分子功能仍 largely 未知。
本研究聚焦于 CFAP221（TGME49_278710），这是一种雄性特异性纤毛和鞭毛相关蛋白，仅在 弓形虫 的有性期表达。通过构建 CFAP221 基因敲除株并制备重组 CFAP221 蛋白，我们评估了其在猫宿主中作为阻断传播疫苗的潜力。
章节摘要
动物伦理声明
猫的免疫和攻毒实验于 2026 年 2 月开始进行。所有动物饲养和实验操作均在标准实验室条件下进行，并符合《中华人民共和国动物管理条例》的规定。本研究方案经华中农业大学实验动物福利与使用委员会批准，批准编号为 HZAUMO-2026-0232（小鼠）和 HZAUCA-2026-0040（猫）。
CFAP221 基因敲除可阻断猫体内卵囊排出
为筛选猫弓形虫病的有效疫苗候选物，本研究聚焦于肠道期特异性表达的、有性发育所必需的抗原。通过分析 弓形虫 猫肠道期阶段的转录组数据，我们选择了 CFAP221——一种在速殖子或缓殖子阶段不表达、但在肠上皮阶段转录水平逐步升高的蛋白（Ramakrishnan 等, 2019）。为研究
讨论
弓形虫 在全球范围内高度流行，主要因为感染猫排入环境的卵囊对中间宿主（包括人类和家畜）构成重大传播风险。疫苗接种仍是控制 弓形虫 传播的最有效策略。然而，目前大多数疫苗候选物，如减毒活菌株、亚单位疫苗和 DNA 疫苗，主要被评估其赋予宿主
结论
本研究证明，CFAP221 基因的缺失对速殖子或缓殖子发育无影响，但特异性地破坏了有性周期，从而消除了卵囊的排出。在终宿主中的评估表明，Δcfap221 株和重组 CFAP221 蛋白对猫均是安全的，均可激发强大的免疫保护，使卵囊排出量减少 70% 以上或实现完全抑制。本研究首次提供了亚单位疫苗
致谢/资金支持
本研究得到国家重点研发计划（2023YFD1802401）和国家自然科学基金委（32325048）的资助。
CRediT 作者贡献声明
Andongma Esack Fonda：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 初稿，监督指导，方法论，数据整理，概念设计。Xiaopei Cao：监督指导，软件，方法论，数据整理。Huiqiang Li：方法论，数据整理。Yimeng Ge：方法论，数据整理。Zhou Zhou：方法论，数据整理。Chaoyue Wang：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 初稿。Bang Shen：撰写 – 审阅与编辑，可视化，监督指导，资金获取，形式分析，
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/人际关系：Bang Shen 有一项提交给华中农业大学的待批专利（编号 #202510730445）。如还有其他作者，他们声明不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或人际关系。
Andongma Esack Fonda | Xiaopei Cao | Huiqiang Li | Yimeng Ge | Zhou Zhou | Chaoyue Wang | Bang Shen
