《Frontiers in Oncology》：Experimental assessment of computationally nominated small molecules targeting the YAP–TEAD interface in Hippo pathway-altered mesothelioma cell models
编辑推荐：
Hippo–YAP/TAZ–TEAD转录轴的异常激活是多种实体瘤的常见特征，并有助于肿瘤维持、谱系可塑性和治疗耐药。近期药物化学研究表明TEAD蛋白是可成药的，但计算机模拟（in silico）筛选所提名的化合物在细胞中显示功能活性的比例仍不清楚，且阴性验证结
Hippo–YAP/TAZ–TEAD转录轴的异常激活是多种实体瘤的常见特征，并有助于肿瘤维持、谱系可塑性和治疗耐药。近期药物化学研究表明TEAD蛋白是可成药的，但计算机模拟（in silico）筛选所提名的化合物在细胞中显示功能活性的比例仍不清楚，且阴性验证结果鲜有报道。在此，研究人员描述了对一组聚焦的计算提名候选化合物的实验评估，这些化合物选自针对YAP–TEAD界面的结构引导虚拟筛选，涵盖约917,000个文库化合物和三个预测结合位点。候选化合物在三种Hippo通路改变的恶性胸膜间皮瘤细胞系（MSTO-211H、NCI-H2052、NCI-H226）中，使用长期（144小时）CellTiter-Glo增殖实验进行评估，并以已验证的TEAD抑制剂K-975和顺铂作为阳性对照，同时在MCF7细胞中使用探索性TEAD响应荧光素酶报告基因。K-975在MSTO-211H和NCI-H2052中产生剂量依赖性抗增殖活性，在NCI-H226中敏感性降低，而顺铂降低所有细胞系的活力。相比之下，计算提名的化合物，包括AG-690/36549045、AN-655/40856217及其他文库成员，在测试浓度下未产生可测量的抗增殖活性。在探索性报告基因实验中，TEAD活性的明显抑制总是与细胞活力丧失同时发生，这种模式与细胞毒性而非选择性转录抑制一致；报告基因检测组中未同时测试TEAD活性参考化合物，也未进行直接的YAP–TEAD生化或靶点参与实验。这些结果描述了YAP–TEAD界面计算提名与基于细胞的活性之间一致性有限的一个案例，并提供了阴性结果的透明记录，为针对Hippo依赖性转录程序的早期发现工作提供了预期参考。
Hippo信号通路通过调控转录共激活因子Yes相关蛋白（YAP）和具有PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ）的活性，控制器官大小、组织稳态和再生。在经典信号中，上游激酶MST1/2和LATS1/2磷酸化YAP和TAZ，使其滞留于细胞质并被蛋白酶体降解。当Hippo信号失调时，YAP和TAZ进入细胞核，与TEA结构域转录因子（TEAD1–4）结合，驱动促进增殖、存活和耐药性的基因程序。恶性胸膜间皮瘤中NF2或LATS1/2的功能缺失改变高频发生，使肿瘤对YAP/TAZ介导的转录输出产生强烈依赖。虽然转录因子长期被认为“不可成药”，但近期发现TEAD蛋白含保守棕榈酰化口袋，可被药理学利用，多种TEAD抑制剂已在Hippo改变的肿瘤模型中显示临床前活性。然而，计算机模拟（in silico）筛选被广泛用于识别候选YAP/TEAD通路调节剂，但被提名化合物中能在细胞中证实功能活性的比例仍不明确，阴性结果极少被报道。为评估计算提名与细胞活性的一致性，研究人员从结构引导的虚拟筛选中选出候选化合物，在多种Hippo改变的间皮瘤模型中用已验证TEAD抑制剂作为阳性对照进行实验评估，并以透明方式记录阴性结果，为未来靶向Hippo依赖性转录程序的药物发现提供参考。结论显示，计算提名的候选化合物未重现K-975的抗增殖活性，在探索性报告基因中的表观活性也与细胞毒性混淆，提示计算提名应结合早期功能与靶点参与验证。
主要技术方法如下：研究人员基于人YAP–TEAD复合物晶体结构（PDB ID: 3KYS），重建缺失残基并制备蛋白，选择YAP α-螺旋界面、TEAD Cys359位点和YAP Phe95位点三个结合口袋，利用AutoDock Vina将来自Otava、Specs和ChemDiv的约917,000个化合物对接至每个位点（共约275万次对接），对排名靠前者进行1 ns分子动力学（MD）模拟和MM/GBSA结合自由能估计，再以100 ns MD验证稳定性。实验评估使用CellTiter-Glo发光法在商业化来源的Hippo改变恶性胸膜间皮瘤细胞系MSTO-211H（LATS1/2缺陷）、NCI-H2052（NF2缺陷）、NCI-H226（NF2缺陷）中进行144小时增殖检测；用RealTime-Glo Annexin V实验在NCI-H226中检测凋亡；用MCF7稳定表达TEAD响应荧光素酶报告基因进行探索性检测，以okadaic acid（0.5 μM）激活，并平行测量细胞活力；IC50通过四参数非线性回归拟合。
研究结果部分：
用已验证的TEAD抑制剂基准测试测定敏感性：在144小时CellTiter-Glo增殖实验中，K-975在MSTO-211H和NCI-H2052中产生剂量依赖性抗增殖活性，IC50分别约为45 nM和85 nM，在NCI-H226中敏感性显著降低（IC50>2,000 nM）。顺铂在100 μM时将所有细胞系活力降至约1–4%，证明检测体系能有效捕捉细胞毒性反应，同时显示不同Hippo改变模型对YAP/TAZ驱动的转录程序依赖性存在异质性。
计算提名的候选化合物AG-690/36549045和AN-655/40856217缺乏抗增殖活性：在相同条件下，这两个结构不同的计算提名化合物在三种细胞系中均未产生亚微摩尔生长抑制，剂量反应曲线平坦，IC50超过最高测试浓度（>2,000 nM），且结果可重复，表明其缺乏选择性抗增殖活性而非未达到有效浓度。
Tiospirone未显示可测量的单药抗增殖活性：Tiospirone在探索性MCF7 TEAD报告基因中未选择性抑制TEAD活性，报告信号下降与细胞活力丧失同步，且单药未诱导凋亡，与其它提名化合物的阴性结果一致。
更广泛的提名化合物组未显示选择性活性：在探索性报告基因中，多种计算提名文库成员在高浓度下降低报告发光，但多数伴随细胞活力平行下降，符合细胞毒性模式而非选择性TEAD转录抑制。没有化合物在无活力丧失的情况下明显抑制报告信号；因未包含TEAD活性参考化合物且使用MCF7细胞，这些数据仅作为探索性结果。
讨论部分强调，对接及MM/GBSA提名的化合物在细胞中未能复制阳性对照的活性，说明计算预测更适合作为优先级排序工具而非活性证据。研究主要缺乏直接靶点参与实验，无法判断化合物是否结合TEAD或破坏YAP–TEAD相互作用；同时未测量溶解度、渗透性和细胞内暴露，递送失败可能影响结果。探索性报告基因因缺少参考化合物并与细胞毒性混淆，不能用于推断通路参与。研究人员指出，透明报告阴性结果有助于减轻发表偏倚，未来应优先开展直接靶点参与检测（如表面等离子体共振、细胞热移位或NanoBRET）、物理化学性质测量，以及在更多Hippo改变模型中使用特异性转录读out（如CTGF/CCN2、CYR61/CCN1、ANKRD1的qPCR）。
研究结论：在针对YAP–TEAD界面的结构引导虚拟筛选及随后的细胞评估中，计算提名的候选化合物在Hippo改变的间皮瘤模型中未能重现已验证TEAD抑制剂的抗增殖活性，探索性TEAD报告基因中的表观活性也被细胞毒性所混淆。这些透明的阴性结果说明了计算提名与细胞活性之间可能出现的一致性有限，并支持在未来的Hippo通路发现工作中将计算机模拟（in silico）提名与早期功能和靶点参与检测相结合。
