《Virology》：Applying Intravirion Staining to Discern Extracellular Vesicles from Viruses with Flow Virometry.
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区分病毒颗粒与细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）对于研究它们在感染中的不同作用至关重要。然而，由于这两种颗粒在大小和蛋白质组成上可能相似，区分病毒与EVs一直是一个长期挑战。在此，研究人员使用流式病毒计数法（Flow Viro
区分病毒颗粒与细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）对于研究它们在感染中的不同作用至关重要。然而，由于这两种颗粒在大小和蛋白质组成上可能相似，区分病毒与EVs一直是一个长期挑战。在此，研究人员使用流式病毒计数法（Flow Virometry, FV）结合双染色策略，该策略将宿主来源抗原的表面抗体标记与病毒衣壳蛋白HIV Gagp24的病毒内染色相结合。该方法揭示了HIV-1病毒储备中EVs（Gagp24阴性颗粒）和病毒（Gagp24阳性颗粒）表面蛋白的显著异质性。双染色方法还成功确认了针对其突出表面抗原的假定EVs和病毒的免疫耗竭。Gagp24浓度降低以及病毒耗竭上清液的感染性下降进一步验证了使用双染色方法区分假定病毒与EVs。此外，免疫耗竭上清液中颗粒的持续存在表明存在具有不同表面抗原谱的EV和病毒亚群。据研究人员所知，这是首次使用FV对完整HIV-1颗粒内抗原进行染色的证明。这些基于FV的双染色方法为更好地区分HIV-1颗粒与EVs提供了强大的新工具，并可能有助于未来研究表征EVs和病毒在感染中的相互作用。
人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）颗粒从宿主细胞释放时，其包膜源自感染细胞的质膜，同时感染细胞也通过相似的生物发生途径释放多种细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）。由于HIV-1与EVs在大小、密度以及表面细胞蛋白组成上高度重叠，长期以来难以可靠区分这两类颗粒。现有分离方法如密度梯度超速离心和免疫印迹难以分辨相似颗粒；常用的四旋蛋白标志物（如CD9、CD63、CD81）在病毒和EVs上均有掺入，而CD45、AChE等EV标志物表达谱有限。因此，亟需开发更特异的工具以解析复杂样本中病毒与EVs的各自贡献。
为应对这一挑战，研究人员开发了基于流式病毒计数法（Flow Virometry, FV）的病毒内染色（Intravirion Staining, IVS）策略，靶向HIV-1衣壳蛋白Gagp24。该蛋白是病毒主要结构成分，在EVs中极少掺入，适合作为区分病毒与EVs的分子标志。研究人员将表面抗原染色与IVS结合，通过皂素（saponin）可逆性透化病毒包膜，使抗Gagp24-FITC抗体进入病毒内部，同时使用PE标记的表面抗体标记表面蛋白，从而在FV上同时检测表面蛋白和内部衣壳信号，实现双染色。
在技术方法上，研究人员使用293T细胞共转染SG3ΔEnv质粒和宿主蛋白表达质粒产生假病毒（Pseudovirus, PV），并使用H9细胞感染HIV-1IIIB、PM1细胞感染HIV-1BaL制备感染性病毒储备。表面染色后，病毒样本用2%多聚甲醛固定，然后在含或不含0.2%皂素的缓冲液中与抗Gagp24-FITC孵育。FV采集遵循MIFlowCyt-EV框架，荧光数据以当量可溶荧光素分子（MESF）校准。免疫耗竭使用protein G磁珠偶联抗CD45、CD147、CD82、HLA-DR或同型对照抗体进行；感染性通过TZM-bl报告细胞测定。
研究结果分为五个部分。3.1 病毒颗粒掺入蛋白的定量受EVs及其相关蛋白的影响：研究人员重新分析先前PBMC来源病毒样本的FV数据，根据粒径设置病毒门（V，100-120nm）和EV门（EV，>120nm）。结果显示，EV门中多种表面抗原（如CD44、CD82、HLA-DR）的颗粒计数和蛋白分子数（PE-MESF）大多显著高于V门，且EV门的蛋白定量与质谱数据呈更强正相关，表明EV信号严重干扰病毒蛋白的批量分析。
3.2 HIV-1衣壳蛋白病毒内染色识别假定病毒颗粒：在假病毒模型中，未透化条件下抗Gagp24-FITC染色仅产生极低信号，而皂素透化后FITC信号显著增加，证明染色针对病毒内部。双染色可以清晰区分仅表面阳性的EV（PE+Gagp24-）和表面与内部双阳性的病毒（PE+Gagp24+），并揭示不同假病毒中EV和病毒的比例差异，如CD26+假病毒以EV为主，CD59+假病毒以病毒为主。
3.3 双染色方法揭示HIV感染T细胞培养上清中病毒和EV群体的异质性：对HIV-1IIIB和HIV-1BaL病毒储备的19种表面蛋白进行双染色，发现CD45几乎集中在EV门，HLA-DR和CD44在EV和病毒上均富集，四旋蛋白（CD63、CD81、CD82）在两类颗粒上均有掺入。值得注意的是，此前被认为是病毒相关蛋白的CD147和CD298实际主要富集于EVs。与病毒免疫捕获实验的Gagp24定量呈正相关（Pearson r=0.6064），验证了新方法的可靠性。
3.4 通过免疫耗竭和双染色可检测不同病毒和EV亚群：用抗CD45和/或CD147包被磁珠耗竭EV，或用抗CD82和/或HLA-DR耗竭病毒后，FV双染色证实目标群体显著减少。同时发现保留的亚群，如CD45+CD147-和CD45-CD147+的EV，以及CD82+HLA-DR-和CD82-HLA-DR+的病毒，表明存在多种亚群，单一标志物不足以完全区分。
3.5 通过感染实验验证免疫耗竭后的假定病毒和EVs：TZM-bl感染实验显示，抗CD45和抗CD147耗竭后，上清液感染性几乎无变化，磁珠上Gagp24极低；而抗HLA-DR耗竭后，磁珠上Gagp24显著升高，上清液感染性显著下降。抗CD82耗竭虽在FV中显示高病毒染色，但磁珠捕获Gagp24较低，可能因抗体克隆表位差异所致。总体而言，感染性下降与Gagp24耗竭量成正比，进一步验证了双染色策略区分病毒与EVs的可靠性。
在讨论部分，研究人员指出靶向Gagp24具有丰度高、易接近等优势，并强调这是首次应用FV对完整病毒颗粒内特异性抗原进行染色。该方法无需纯化或浓缩即可在混合样本中分辨病毒和EV亚群，且比传统免疫捕获更省时省力。研究也承认其局限性：当前无法绝对定量颗粒丰度，低丰度蛋白的检测限尚未确定，且不能判断感染性病毒颗粒数量。结论部分，研究人员认为基于FV的双染色方法为更好地区分HIV-1颗粒与EVs提供了强大新工具，有助于未来研究表征EVs与病毒在感染中的相互作用。
