未折叠蛋白反应诱导蛋白ULI1通过强化Ehrlich途径介导酿酒酵母中芳香醇的生物合成

《Frontiers in Microbiology》：An unfolded protein response-inducible protein (ULI1) mediates aromatic alcohols biosynthesis through reinforcing the Ehrlich pathway in Saccharomyces cerevisiae

　　

专业术语翻译的论文摘要 芳香醇如2-苯乙醇（2-PE）和色醇（TOL）具有多种生物学功能。本研究利用CRISPR-Cas9系统，对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的一个未折叠蛋白反应诱导基因 ULI1 和一个乙醛脱氢酶基因 ALD3 进行了破坏。发酵实验结果显示，与野生型菌株KMLY1-6相比，ULI1 移码突变体（Kmuli1）和敲除突变体（KΔuli1）的2-PE和TOL产量均显著降低，分别保留了46.32%和64.54%的2-PE产量，以及34.61%和77.73%的TOL产量。相反，ALD3 的敲除则适度提高了2-PE和TOL的产量，增幅分别为4.98%和20.57%。这些结果表明，ULI1 和 ALD3 都参与了酿酒酵母中2-PE和TOL的生物合成。为进一步确认 ULI1 的作用，研究人员构建了三个染色体整合表达（CIE）菌株（KXuli1, KXIIuli1, KΔald3uli1）和一个基于质粒的表达（PBE）菌株（BY4741/pY26-uli1）。与对照菌株KMLY1-6相比，CIE菌株的2-PE和TOL产量分别增加了10.13–12.91%和25.76–29.28%。同时，PBE菌株产生的2-PE和TOL水平显著高于空载体对照（BY4741/pY26），在培养60小时时检测到最大增幅，分别为38.80%和30.86%。为了进一步阐明 ULI1 在2-PE和TOL生物合成中的分子机制，研究人员对Kmuli1 vs. KMLY1-6进行了比较转录组学分析，并对BY4741/pY26-uli1 vs. BY4741/pY26进行了转录组学和蛋白质组学分析。多组学结果显示，ULI1强化了Ehrlich途径，调节了代谢流，维持了线粒体结构和细胞蛋白稳态，并协调了应激反应与代谢重分配。总之，ULI1作为一个连接酿酒酵母中胁迫耐受性和细胞稳态的新型调控枢纽，并通过加强Ehrlich途径促进芳香醇的生物合成。

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研究背景

芳香醇是一类具有重要经济价值的化合物，广泛应用于食品、化妆品和制药等行业。其中，2-苯乙醇（2-PE）因具有宜人的玫瑰香气而备受关注，而色醇（TOL）则展现出抗病毒、促进植物生长等多种生物活性。目前，这两种芳香醇主要通过化学合成或植物提取获得，但这些方法存在环境不友好、成本高或供应不稳定等问题。因此，利用微生物发酵进行生物合成成为了一种绿色且有前景的替代方案。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为一种公认安全的模式工业微生物，是理想的合成生物学底盘细胞。在酵母中，芳香醇主要通过两条途径合成：一是从芳香族氨基酸出发的Ehrlich途径，二是由葡萄糖从头合成的 de novo 途径。尽管已知一些调控蛋白参与此过程，但关于未折叠蛋白反应（UPR）与芳香醇生物合成之间的关联此前未见报道。本研究旨在探索一个受UPR诱导的基因 ULI1 在芳香醇生物合成中的作用及其分子机制，为高效生产芳香醇提供理论支持和遗传资源。

研究方法与技术

为探究 ULI1 和 ALD3 的功能，研究人员采用了以下关键技术：

1. 1.
   CRISPR-Cas9基因编辑系统：用于构建 ULI1 的移码突变体（Kmuli1）、敲除突变体（KΔuli1）以及 ALD3 的敲除突变体（KΔald3）。
2. 2.
   基因表达工程：通过染色体整合表达（CIE）和基于质粒的表达（PBE）两种策略，在不同基因组位点（X-3, XII-3）或替换 ALD3 基因来过表达 ULI1。
3. 3.
   高通量测序与质谱技术：对野生型和突变株进行RNA测序（RNA-seq）以获得转录组数据；对过表达菌株进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析以获得蛋白质组数据。

研究结果

3.1 ULI1 和 ALD3 基因的生物信息学特征

通过序列分析发现，ULI1 编码一个含有信号肽和跨膜结构域的膜结合蛋白，预测定位于内质网（ER）。而 ALD3 编码一个含有ALDH样结构域的胞质蛋白。系统发育分析表明，ULI1同源蛋白仅存在于 Saccharomyces 属中，具有属特异性。

3.2 基因破坏揭示 ULI1 参与2-PE和TOL的生物合成

通过CRISPR-Cas9破坏 ULI1 基因后，研究人员发现其移码突变体（Kmuli1）和敲除突变体（KΔuli1）的2-PE和TOL产量均显著低于野生型。相比之下，ALD3 的敲除反而略微提升了这两种芳香醇的产量。这表明 ULI1 正调控，而 ALD3 负调控芳香醇的生物合成。动力学分析进一步证实，ULI1 的突变导致2-PE和TOL在整个培养周期内的产量持续低于野生型。

3.3 基因表达分析证实 ULI1 参与2-PE和TOL的生物合成

通过在多个基因组位点过表达 ULI1，研究人员发现所有过表达菌株的2-PE和TOL产量均有显著提高。同样，在实验室标准菌株BY4741中过表达 ULI1 也获得了类似的结果，证实了 ULI1 以剂量依赖的方式促进芳香醇的合成，并且这种作用在不同酵母菌株中是保守的。

3.4 ULI1 破坏株的转录组测序及差异表达基因分析

对Kmuli1与野生型的比较转录组分析显示，两组差异表达基因（DEGs）共同富集于硫胺素代谢通路。这表明ULI1可能通过调控硫胺素代谢来影响2-PE和TOL的合成，因为Ehrlich途径中的脱羧反应严格依赖于硫胺素焦磷酸（TPP）作为辅酶。

3.5 ULI1 过表达株的转录组测序及差异表达基因分析

对BY4741中过表达 ULI1 的转录组分析显示，DEGs显著富集于线粒体组织、蛋白酶体功能和线粒体自噬等通路。这暗示ULI1可能通过维持细胞器结构（特别是线粒体）和蛋白稳态来发挥作用。

3.6 ULI1 过表达株的蛋白质组测序及差异表达蛋白分析

蛋白质组分析进一步揭示，ULI1 过表达导致与分解代谢相关的蛋白（如碳代谢、色氨酸代谢、三羧酸循环）丰度上调，而与合成代谢相关的蛋白（如氨基酸生物合成）丰度下调。这种代谢流的重排有利于将资源转向芳香醇的生产。

3.7 热图聚类分析

热图分析显示，在蛋白质层面，ULI1 过表达株中Ehrlich途径的关键酶（如转氨酶ARO9、脱羧酶ARO10和PDC5、醇脱氢酶ADH2和ADH4）、硫胺素调控蛋白、转录因子ARO80以及NADH再生相关蛋白LPD1均显著上调。这直接证明了ULI1通过强化整个Ehrlich途径来促进芳香醇的生物合成。

总结与讨论

综合多组学分析结果，研究人员提出了ULI1的工作模型：作为一种内质网膜蛋白，ULI1在营养缺乏和内质网胁迫下被激活，它像一个多效性调控枢纽，通过协调硫胺素代谢、维持线粒体结构和蛋白稳态、促进分解代谢并抑制非必需合成代谢，最终将代谢流导向Ehrlich途径，从而增强2-PE和TOL的合成。

研究结论

本研究阐明了ULI1——一种 Saccharomyces 属特异性的内质网膜蛋白——的生物信息学特征和调控功能。基因敲除和过表达实验证明，ULI1以剂量依赖的方式正向调控2-PE和TOL的生物合成，而ALD3则通过竞争关键的醛类前体负向影响芳香醇的产生。多组学分析揭示，ULI1并不直接催化芳香醇的合成，而是作为一个多效性调控因子，连接内质网应激反应、细胞器稳态和中心代谢。ULI1可能通过协调硫胺素和线粒体代谢、增强分解代谢通量并抑制非必需合成过程，优化能量利用并将代谢前体重定向至2-PE和TOL的生产。这些结果为未来通过代谢工程改造酿酒酵母以提高高价值芳香醇的工业化生产提供了重要的机制见解和有前景的靶点。