W波段dHis-Cu(II)距离测量：窄带宽脉冲激发挑战的导航

《Physical Chemistry Chemical Physics》：dHis-Cu(ii) based EPR distances at W-band: navigating the challenges of excitationOpen Access

　　

专业术语翻译的论文摘要 利用脉冲偶极EPR光谱(PDS)测量纳米级距离约束已成为整合生物物理学中不可或缺的工具。将刚性自旋标记物(如Cu(II)-NTA)与高频EPR相结合，对于高精度测量结构信息具有吸引力。然而，此类测量受到有限激发带宽的挑战，这可能导致数据采集和分析两方面的复杂性。本文研究了在W波段(约95 GHz)对Cu(II)标记蛋白质进行的距离测量。g张量的巨大各向异性导致谱宽约为十GHz。因此，使用带宽小三个数量级的脉冲来获取与取向无关的偶极迹线变得非常困难。研究人员利用最近开发的计算方法表明，仅在四个场位置进行采集就足以获得取向平均的距离分布。该采集方案总共仅激发约0.43%的自旋。该计算方法在两个双标记GB1蛋白样品的数据上得到了验证。研究人员预计，这种概念性方法将对各种高场脉冲EPR测量有用。

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研究背景与问题

脉冲偶极EPR光谱(PDS)是结构生物学中一种重要的工具，能够在15至160?范围内测量一对自旋标记物之间的距离分布。该方法无需结晶即可测量冷冻溶液中生物分子的完整构象系综，且仅对顺磁物种敏感，避免了周围抗磁性分子的干扰。最常用的蛋白质自旋标记物MTSSL(R1)含有氮氧自由基作为EPR报告基团，但通常包含五个或更多可旋转键的连接子，导致距离分布因自旋标记物的旋转异构体分布而超出骨架构象系综的范围。因此，PDS距离测量的一个局限性在于如何将自旋-自旋距离分布转化为骨架构象系综。

为了更准确地反映蛋白质骨架的距离分布，研究人员开发了刚性自旋标记物，包括使用双半胱氨酸连接子的标记物、在肽合成过程中掺入的非经典顺磁氨基酸，以及依赖双组氨酸(dHis)残基配位的过渡金属标记物，如Cu(II)-次氮基三乙酸(Cu(II)-NTA)。这类刚性标记物产生更窄的距离分布，比柔性自旋标记物更精确地报告生物分子距离，但通常以灵敏度为代价。

更高频率的PDS实验受益于浓度灵敏度的提升，例如DEER在Q波段(约34.5 GHz)的信噪比(SNR)比X波段(约9.5 GHz)高十三倍，而W波段(约94.5 GHz)则可将灵敏度提高三十倍。然而，对于Cu(II)，更高频率增加了EPR谱的谱宽，从X波段的约1.8 GHz扩展到Q波段的约4.5 GHz，再到W波段的约10 GHz。这减少了给定脉冲带宽所激发的自旋数，并导致基于自旋相对于外加磁场方向的取向选择性采样。对于dHis结合的Cu(II)-NTA，自旋取向与自旋间矢量取向之间存在强相关性，使得PDS信号同时依赖于自旋间距离和被采样自旋对的自旋间矢量取向，给数据采集和分析带来挑战。

研究方法概述

研究人员采用计算模拟与实验验证相结合的方法。首先建立包含50000个自旋对的计算机(in silico)样本，每个自旋对由两个与g_∥共线的自旋矢量组成，并通过自旋间矢量分离。利用EasySpin的pepper模块拟合实验场扫描电子自旋回波(FS-ESE)谱，确定展宽参数。通过计算φ曲线(被激发自旋取向数随场的函数)来确定最优采集场位。模拟五脉冲弛豫诱导偶极调制增强(RIDME)实验，并计算模拟信号与理想取向平均信号之间的χ²值来量化取向选择性程度。在HiPER W波段光谱仪上进行实验验证，样品为两种双标记的免疫球蛋白结合B1结构域(GB1)突变体。

研究结果

创建Cu(II)-NTA W波段计算机样本：研究人员创建了包含50000个自旋对的计算机样本，每个自旋对的两个自旋由与g_∥共线的矢量表示。自旋对的相对取向由三个角度参数χ、γ和η描述，每个角度从高斯分布中采样，标准差设为10°以保守模拟Cu(II)-NTA在GB1上的刚性。共振场由有效g值和A值计算，其中g_∥=2.277，A_∥=162 G，g_⊥=2.057，A_⊥=10 G。通过引入与取向相关的展宽参数β_?改进了之前的模型，更好地模拟了实验FS-ESE谱。

计算第一个φ曲线：通过计算每个场位处被激发自旋取向的数量得到φ曲线。对于W波段的Cu(II)-NTA，φ曲线最大值位于距FS-ESE最大值-125 G处，偏离了规范的g_⊥位置，这是由于具有70°-90°范围?值的自旋谱线形状重叠所致。

RIDME计算与取向选择性量化：研究人员在距最大场位-125 G处模拟RIDME实验，计算每个激发自旋对的偶极频率，并考虑翻转概率加权求和得到时间域信号。通过与理想取向平均信号的χ²比较发现，单一场位的模拟RIDME信号振荡阻尼减小，表明存在取向选择性，特别是过采样了θ=90°的情况。对125种不同相对取向的系统测试显示，只有在已知相对取向的先验知识时，单一场位采集才可靠。

额外场位的生成与优化采集方案：通过移除之前激发的自旋对并重新计算φ曲线，研究人员确定了五个场位：距谱最大值-125 G、-657 G、-1274 G、-1978 G和-2432 G。测试所有可能的场位组合后发现，最佳的四场采集方案包括-125 G、-657 G、-1282 G和-2432 G位置，其χ²最大值为0.13，与理想信号差异极小。五场采集方案的χ²最大值为0.06，改进有限。四场采集方案在所有125种相对取向上都能充分平均时间域数据。

实验验证：研究人员在两种GB1突变体(E15H/T17H/K28H/Q32H和I6H/N8H/K28H/Q32H)上进行了RIDME实验。在八个场位收集数据，结果显示不同场位的时间迹线存在明显差异，高频场位的时间迹线振荡频率高于其他场位。通过四场和五场采集方案获得的距离分布与预期一致，验证了计算方法的有效性。

讨论与结论

研究表明，尽管W波段Cu(II)-NTA的谱宽约10 GHz，而所用脉冲仅激发不到1%的谱，但只需四到五个场位即可获得取向平均的PDS数据。值得注意的是，这些场位均不在规范的g张量位置。该方法的关键考虑因素包括：自旋对的取向灵活性(本研究使用10°标准偏差)、展宽参数的校准(需通过模拟FS-ESE谱确定)以及脉冲带宽(48 ns脉冲可实现，更长脉冲可能需要更多场位)。

研究结论认为，利用最近开发的计算方法，仅在四个场位进行采集就足以获得取向平均的距离分布，该采集方案总共仅激发约0.43%的自旋。该方法在两种双标记GB1蛋白样品上得到验证，预计将对各种高场脉冲EPR测量具有广泛适用性。