《Toxicology in Vitro》：Ultrastructural assessment of medically relevant levels of synthesized nanosilver-exposed canine blood mononuclear leukocytes reveals irreversible immunocytotoxicity
编辑推荐：
•犬外周血单核细胞（PBMCs）暴露于生物医学不同浓度和暴露时间的绿色合成纳米银（AgNPs）。•通过基于Annexin V/PI的定量流式细胞术和PBMCs的描述性超微结构变化进行评估。•随着AgNPs浓度和暴露时间的增加，PBMCs死亡呈进行性发展。•PBMCs死亡特征以
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犬外周血单核细胞（PBMCs）暴露于生物医学不同浓度和暴露时间的绿色合成纳米银（AgNPs）。
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通过基于Annexin V/PI的定量流式细胞术和PBMCs的描述性超微结构变化进行评估。
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随着AgNPs浓度和暴露时间的增加，PBMCs死亡呈进行性发展。
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PBMCs死亡特征以及膜改变、细胞器破坏和细胞完整性丧失揭示了AgNPs明显的免疫毒性效应。
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所观察到的AgNPs暴露下PBMCs的死亡和形态学特征强调了敏感性暴露管理的重要性。
引言
纳米银颗粒（AgNPs）因其抗菌、抗真菌和抗病毒特性，已被广泛应用于医疗、制药和健康领域（Salleh等人，2020）。这些纳米颗粒根据其尺寸，通过膜相关摄取和内化作用容易与活细胞和微生物相互作用，从而影响其化学和生物特性（Zhang等人，2016；Abou El-Nour等人，2010；Xiong等人，2022）。这些特性使AgNPs成为癌症治疗、疤痕修复、传感器开发、涂层系统和抗微生物覆盖物的潜在候选材料（Ratan等人，2020；Khorasani等人，2009）。最近，AgNPs被认为是癌症治疗的一种前瞻性策略，因为它们具有诱导细胞应力的能力，这可能激活癌细胞中的凋亡通路（Pirutin等人，2025；Sargsian等人，2024；Ullah等人，2020；Flores-López等人，2018；Rohde等人，2021）。先前的研究报告指出，这些纳米颗粒可诱导癌细胞产生细胞应力，并损伤DNA和细胞膜，从而可能促进细胞凋亡（Ullah等人，2020；Flores-López等人，2018）。AgNP诱导的细胞毒性可能涉及多种与纳米颗粒相关的细胞反应。因此，在特定实验条件下，AgNPs正被用作针对耐药肿瘤的靶向治疗手段，与常规方法相比，其可能对健康组织的损伤较小（Rohde等人，2021）。然而，AgNPs的广泛使用引发了对其在人体中毒性和稳定性的担忧（Skalska和Stru?yńska，2015；Kim和Ryu，2013；Jaswal和Gupta，2023；Christensen等人，2010；Vazquez-Mu?oz等人，2017）。
研究表明，AgNPs在某些条件下可轻易突破生物屏障，如血脑屏障、血奶屏障和血睾屏障等，从而使其能够进入肝脏、脾脏、大脑和免疫系统等敏感器官（Ferdous和Nemmar，2020；Tang等人，2009；Sharma等人，2009）。这可能导致AgNPs在这些组织中积累，产生毒性效应和长期损伤，包括细胞破坏、DNA损伤以及通过凋亡和坏死途径促进细胞死亡过程。暴露条件如AgNP浓度和暴露时长对细胞毒性结果有强烈影响（Taká?等人，2025；Recordati等人，2021；Castiglioni等人，2014）。与此同时，关键的免疫细胞尤其是外周血单核细胞（PBMCs），由于其对身体防御和免疫反应调节的关键作用，成为研究AgNPs毒性效应的重要靶标。作为循环免疫细胞，PBMCs是最早接触进入血液的纳米颗粒的细胞群体之一（Aguirre-León等人，2025；Vukovi?等人，2021）。PBMCs主要包括B淋巴细胞、T淋巴细胞和单核细胞，其对细胞应力和外来材料的毒性效应具有复杂的反应（Greulich等人，2011）。因此，这些细胞对AgNPs的敏感性及其可能的结构差异和细胞死亡强调了该领域进一步研究的必要性（Vukovi?等人，2020）。
鉴于狗作为伴侣动物日益重要的作用，维持其健康和免疫功能具有重要的兽医意义。此外，犬PBMCs可能为免疫学研究提供一个有用的比较体系，因为犬和人的免疫反应具有多种共性的细胞和功能特征，尽管仍然存在重要的种属特异性差异（Chow等人，2024）。本研究旨在调查AgNPs在不同浓度和暴露时间下对犬PBMCs的毒性影响，以及它们如何从细胞学和超微结构角度影响凋亡和坏死。本研究的成果可为理解AgNPs对免疫细胞反应的影响提供全面认识，并为AgNPs在医疗和生物技术应用中的更安全、可控使用提供依据。
章节摘要
动物和血液采样
本研究在德黑兰大学兽医学院Rastegar实验室进行。从三只成年马士提夫犬（Qahdarijani）中采集外周血样本，平均年龄约3岁，平均体重约60 kg；每只犬作为流式细胞术分析的独立生物学重复（n = 3）。所有动物操作均按照机构关于实验室动物照顾和使用的指南进行，并获得了批准。
绿色合成AgNPs的表征
图1.（b）SEM–EDS图谱显示了可归因于Ag的特征峰，证实了所分析样品中银的存在。Al和Au信号分别归因于铝基板和金涂层。尽管SEM–EDS证实了Ag的存在，但未能确定其氧化态或结晶相。图1(c) DLS分析得出表观Z平均流体动力学直径为168.6 nm，PDI为0.322，表明呈中等多分散性。
结论
本研究采用基于Annexin V/PI的流式细胞术和超微结构分析，评估了绿色合成银纳米颗粒对犬外周血单核细胞的浓度相关和时间相关效应。AgNP浓度在所有四项流式细胞术结果中均产生了明确且统计学显著的变化。这种浓度相关效应在24小时后尤为明显，此时平均Q4活力从无处理组的~90 ± 3.25%开始逐步下降。
CRediT作者贡献声明
Amirali Tabatabaei：撰写——审阅与编辑，撰写——原稿，可视化，验证，软件，方法学，调查，形式化分析，数据管理。Nazanin Tabatabaei：撰写——审阅与编辑，撰写——原稿，可视化，验证，软件，方法学，形式化分析，数据管理。Behnam Mehrzad：撰写——审阅与编辑，撰写——原稿，可视化，验证，软件，资源，方法学，调查，形式化分析，数据。
伦理声明
本实验中所描述的所有实验程序均经德黑兰大学兽医学院动物研究伦理委员会批准。本研究符合伊朗法律（批准号IR.UT.VETMED.REC.1403.017）和欧盟动物实验指令2022/06/07，并遵守ARRIVE指南。主要的伦理问题在于从犬只中采集血液样本，以用于犬巨噬细胞样单核细胞的制备。
Amirali Tabatabaei | Nazanin Tabatabaei | Behnam Mehrzad | Michael Achterberg | Jalil Mehrzad
